ホルマリン固定癌組織標本の腫瘍免疫研究の自動多重蛍光パネル
Summary
詳細なプロトコル 6 マーカー多重蛍光パネルの最適化し、実行より一貫した結果と手続き時間の短縮のため自動着色剤を使用しています。このアプローチは、腫瘍免疫研究のあらゆる研究室で直接対応できます。
Abstract
免疫腫瘍で継続的な発展には、癌免疫学のメカニズムの理解は深まるが必要があります。ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 生検から組織サンプルの immunoprofiling 解析は、腫瘍免疫の複雑さを理解し、がん免疫療法の新規予測バイオ マーカーの発見のための重要なツールになりました。組織の Immunoprofiling 解析では、腫瘍微小環境における炎症性細胞の亜集団と免疫チェックポイントを含む結合のマーカーの評価が必要です。新規多重免疫組織化学的手法の出現 1 つティッシュ セクションのより効率的な役立つ multiparametric 分析標準 monoplex 免疫染色 (IHC) よりもできます。1 市販多重蛍光抗体法 (IF) 法はパスチラミドシグナル信号増幅に基づくし、マルチ スペクトル顕微鏡による分析と組み合わせる組織における多様なマーカーの良い信号分離できます。この方法は、標準の IHC FFPE 組織サンプルでの最適化された非標識一次抗体の使用と互換性があります。ここ述べる多重ができる自動プロトコル PD L1 で構成される 6 マーカー多重抗体パネルと癌組織サンプルのラベルする場合 PD 1、CD68、CD8、Ki 67、および 4 ‘ と AE1/AE3 サイトケラチン 6-diamidino-2-phenylindoleとして細胞核対比染色。多重パネル プロトコルは染色時間が手動の議定書のより短いと直接適用でき、人間 FFPE 組織サンプルでの腫瘍免疫研究のすべての研究室捜査官適応自動 IHC 着色に最適です。いくつかのコントロールと最適化と手法の検証に役立つ新しい多重の場合パネルの細かい品質制御ドロップ コントロール メソッドを含むツールがまた説明されます。
Introduction
免疫腫瘍学研究、特に発見と臨床試験1 のコンテキストでの癌免疫療法の新規予測バイオ マーカーの検証のために不可欠なコンポーネントとなっている FFPE 腫瘍組織サンプルの Immunoprofiling 分析 ,2。ジアミノベンジジンなど化学色原体を使用して、発色の IHC 病理生検組織3の反応の標準的な手法のままです。標準 IHC はがん組織 immunoprofiling、腫瘍関連リンパ球のサブポピュレーションとプログラムされた細胞死配位子 1 など免疫チェックポイントの発現レベルの評価 (PD L1)4 の定量などにも使用できます。 ,5。標準 IHC は限られた、しかし、ティッシュ セクションごとに 1 つだけ抗原のラベル付けできます。Immunoprofiling 研究は、通常いくつかのマーカーの組み合わせの式の解析を必要とするため複数の組織切片の染色標準 IHC の使用が必要になります, 各単一のマーカーの染色し、したがって、コア針生検など小さい組織サンプルの解析に大幅に制限されます。標準 IHC 法または PD L1、腫瘍関連マクロファージおよび癌細胞によって表現されるなど免疫チェックポイント マーカーよくの多様な細胞集団で行ったマーカーの評価のために制限されます。この制限は、標準 monoplex IHC の使用などのさまざまな細胞タイプ6によって表される IHC マーカーの定量分析のための病理学者によって報告されています。ちょうど少数の反応によって制限されているものの、標準 IHC monoplex 方法、7以上同じティッシュ セクションを表すの多様な塗装色原体の進歩を用いた多重発色 IHC 技術の開発マーカーも同じ細胞集団の同じ細胞内コンパートメントに発現するタンパク質の適切な評価のための重要な技術的な課題を提示。
多重の発色 IHC 法の制限と同様、臨床サンプルから組織の可用性に関する上記の注意事項は、腫瘍免疫研究に基づく多重化法の改良を開発する必要性に上昇を与えています。蛍光標識は、同じスライドから複数の同時の信号を分離することができます効果的にシステムをイメージングと組み合わせます。このような手法の 1 つは、効率的な色分離8のマルチ スペクトル顕微鏡イメージングと組み合わせるパスチラミドシグナル信号増幅 (TSA) に基づいています。市販の TSA ベース キット採用 fluorophores マルチ スペクトル イメージング8用に最適化 (材料の表を参照してください)。このシステムの重要な利点は、検証および標準的な発色 IHC9,10,11用に最適化された同じ非標識一次抗体との互換性です。これは、新しいターゲットを組み込む最適化とパネルの変更で高速化だけでなく、柔軟性をことができます。Monoplex からの簡単な転送を可能にする、自動化された市販の IHC 着色システムのための多重蛍光 (mIF) TSA メソッドの最適化さらに、mIF に発色 IHC。
ここで腫瘍免疫研究に基づいている mIF パネル自動 mIF TSA 染色とイメージングのための多重分光スキャナーを使用してプロトコルを提案します。このプロトコルは、適応および記述されている計測・試薬へのアクセスを持つ研究室ユーザで変更できます。プロトコルには、癌の immunoprofiling の六つの一次抗体のパネルが含まれています: PD-L1、PD 1、CD68 (パン ・ マクロファージ マーカー) として、CD8 (T 細胞傷害性細胞)、キ-67 と AE1/AE3 の同定に上皮性マーカーとして使用 (汎サイトケラチン、癌細胞)。最近の研究では、染色12多重化を検証するための標準の参照として発色 IHC を使用して手動 TSA mIF プロトコルの最適化について説明します。自動着色剤、また染色の一貫性を向上させながら 14 時間 3-5 日から染色時間を飛躍的に短縮で最適化された市販の七色の TSA キットを使用して更新されたメソッドここで紹介をしました。ここで示した詳細な主なプロトコル、に加えて補足資料セクションには「ドロップ コントロール」法、最適化ためのテクニカル ノートと同様、新しい mIF パネルを評価する追加の品質管理プロセスが含まれていますトラブルシューティング、およびセットアップおよびカスタマイズされた mIF パネルの mIF TSA メソッドを最適化する研究所ユーザーを支援する新しい多重パネルの開発。
Protocol
Representative Results
Discussion
継続的な癌免疫療法革命は開口部小説と有望な治療方法がん患者13。免疫腫瘍学の分野の進歩の炎症性の腫瘍微小環境、発癌に関与する免疫学的メカニズムの生物学を理解するだけでなく、新しい予測バイオ マーカーを見つけることも増加の知識が必要になります免疫療法を用いた治療法1,2。がん免疫の複雑な生物学による腫瘍?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
編集のサポートは、MedImmune のデボラ シュマンによって提供されました。
Materials
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
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