Automatisierte Multiplex Immunfluoreszenz Panel für Immuno-Onkologie-Studien auf Formalin fixiert Karzinom Gewebeproben
Summary
Ein detailliertes Protokoll für ein sechs-Marker multiplex Immunfluoreszenz-Panel optimiert und durchgeführt ist, mit Hilfe einer automatisierten Stainer für konsistentere Ergebnisse und eine kürzere Verfahrensdauer. Dieser Ansatz kann direkt von jedem Labor für Immuno-onkologischen Studien angepasst werden.
Abstract
Weiterentwicklungen in der Immuno-Onkologie erfordert ein besseres Verständnis der Mechanismen der Krebsimmunologie. Die Immunoprofiling Analyse von Gewebeproben aus Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Biopsien ist ein wichtiges Instrument für das Verständnis der Komplexität der Tumorimmunologie und entdecken neue Prädiktive Biomarker für Krebsimmuntherapie geworden. Immunoprofiling Analyse der Gewebe erfordert die Beurteilung von kombinierten Markierungen, einschließlich der entzündlichen Zelle Subpopulationen und immun Checkpoints in den Tumor Mikroumgebung. Das Aufkommen der neuen multiplex immunhistochemischen Methoden ermöglicht eine effizientere multiparametric Analyse der einzelnen Gewebeschnitte als standard Monoplex Immunhistochemie (IHC) tut. Eine handelsübliche multiplex Immunfluoreszenz ermöglicht (IF) Methode basiert auf Tyramide-Signalverstärkung und kombiniert mit multispektralen mikroskopische Analyse eine bessere Signaltrennung der verschiedenen Markierungen im Gewebe. Diese Methodik ist kompatibel mit dem Einsatz von unconjugated primäre Antikörper, die für standard IHC an FFPE Gewebeproben optimiert wurden. Hierin beschreiben wir ausführlich eine automatisierte Protokoll, das Multiplex-ermöglicht wenn Kennzeichnung von Karzinom Gewebeproben mit einem sechs-Marker Multiplex-Antikörper-Panel bestehend aus PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 und AE1/AE3 Cytokeratin mit 4 ‘, 6-Diamidino-2-Phenylindole als eine atomare Zelle Gegenfärbung. Das Multiplex-Panel-Protokoll ist in einem automatisierten IHC Stainer Färbung Zeit optimiert, die ist kürzer als die des manuellen Protokolls direkt angewendet und werden von jedem Labor Investigator für Immuno-Onkologie-Studien an menschlichen Gewebeproben der Proteinkinase angepasst. Ebenfalls beschrieben sind mehrere Steuerelemente und Werkzeuge, einschließlich Drop Steuerungsmethode für feine Qualitätskontrolle eines neuen Multiplex-IF-Panels, die nützlich für die Optimierung und Validierung der Technik sind.
Introduction
Immunoprofiling Analyse von Gewebeproben FFPE Tumor ist ein wesentlicher Bestandteil der Immuno-Onkologie-Studien, insbesondere für die Entdeckung und Validierung der neue Prädiktive Biomarker für Krebsimmuntherapie im Rahmen von klinischen Studien1 geworden. ,2. Chromogene IHC mit chemischen Chromogens wie Diaminobenzidine, bleibt die Standardtechnik in der diagnostischen Pathologie für die Immunolabeling der Biopsie Gewebe3. Standard IHC einsetzbar auch für Krebs-Gewebe-Immunoprofiling, einschließlich die Quantifizierung der Subpopulationen von Tumor-assoziierten Lymphozyten und die Beurteilung der Ausdruck Niveaus von immun Prüfpunkten wie programmierten Zelle Tod Liganden 1 (PD-L1)4 ,5. Standard IHC ist begrenzt, jedoch, dass nur ein Antigen pro Gewebe Abschnitt bezeichnet werden kann. Da Immunoprofiling Studien in der Regel die Analyse der kombinierten Ausdruck mehrere Markierungen erforderlich, erfordern den Einsatz von standard IHC würde die Färbung von mehreren Gewebeschnitten, die jeweils mit einer einzigen Markierung befleckt und, daher wäre wesentlich begrenzt für die Analyse von kleinen Gewebeproben wie Kern Nadel Biopsien. IHC Standardmethoden beschränken sich auch für die Bewertung von Markern, die coexpressed sind durch unterschiedliche Zellpopulationen, wie üblich mit immun Checkpoint Marker wie PD-L1, die durch Tumor-assoziierten Makrophagen und Krebszellen zum Ausdruck kommt. Diese Einschränkung wurde in, zum Beispiel die Verwendung von standard Monoplex IHC von Pathologen für die Quantitative Analyse eines IHC-Markers geäußerten unterschiedlichen Zelle Arten6berichtet. Die Entwicklung von multiplex chromogenen IHC-Techniken mit unterschiedlichen farbigen Chromogens auf die gleichen Gewebe Abschnitt stellt eine Weiterentwicklung gegenüber der standard IHC Monoplex-Methode,7 bleiben begrenzt durch die Immunolabeling von wenigen Marker und stellen auch eine wichtige technische Herausforderung für die ordnungsgemäße Bewertung der Marker in der gleichen subzelluläre Fächer die gleichen Zellpopulationen ausgedrückt.
Die genannten Vorbehalte bezüglich Gewebe Verfügbarkeit von klinischen Proben, als auch die Grenzen der multiplex chromogenen IHC Techniken, haben zu der Notwendigkeit, verbesserte Multiplex-Verfahren für Immuno-Onkologie-Studien auf der Grundlage entwickeln geführt. fluoreszierende Kennzeichnung in Verbindung mit imaging-Systemen, die effektiv die Signale von mehreren Fluorophore von derselben Folie trennen können. Eine solche Technik basiert auf Tyramide Signalverstärkung (TSA) in Kombination mit multispektralen Mikroskopie Imaging für effiziente Farbe Trennung8. Eine handelsübliche TSA-basierte Kit beschäftigt Fluorophore für multispektrale bildgebenden8 optimiert (siehe Tabelle der Materialien). Ein entscheidender Vorteil dieses Systems ist seine Kompatibilität mit den gleichen unbeschriftete primäre Antikörper, die bereits überprüft und optimiert für standard chromogenen IHC9,10,11. Dies ermöglicht nicht nur die schnellere Optimierung, sondern auch die Flexibilität in der Optimierung und Panel Modifikationen unter Einbeziehung neuer Ziele. Darüber hinaus kann die Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF) TSA Methode für kommerziell erhältliche automatisierte IHC Stainer Systemen, so dass für einen einfachen Transfer vom Monoplex optimiert werden chromogenen IHC, mIF.
Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine mIF-Panel für Immuno-Onkologie-Studien auf der Grundlage mIF TSA Färbung automatisiert und einen multispektralen Scanner für die Bildgebung verwendet. Dieses Protokoll kann angepasst und geändert von jedem Labor-Benutzer mit Zugriff auf die beschriebenen Instrumente und Reagenzien. Das Protokoll enthält eine Gruppe von sechs primäre Antikörper für die Immunoprofiling Karzinome: PD-L1, PD-1, CD68 (als Pan-Makrophagen Marker), CD8 (zytotoxische T Zellen), Ki-67 und AE1/AE3 (Pan-Cytokeratin, verwendet als eine epitheliale Marker zur Identifizierung von Karzinomzellen). Eine aktuelle Studie beschreibt die Optimierung eines manuellen TSA-mIF-Protokolls mit chromogenen IHC als Standardwerk, um das Multiplex12Färbung zu validieren. Die hier vorgestellte aktualisierte Methode wurde entwickelt durch mit einem handelsüblichen, sieben-Farb TSA-Kit in einem automatisierten Stainer, drastisch Verkürzung der Färbung von 3 – 5 Tagen, 14 h, während gleichzeitig die Konsistenz der Färbung optimiert. Neben der detaillierten wichtigsten Protokoll hier vorgestellten enthält einen Abschnitt, Zusatzmaterialien “Drop-Control”-Methode, eine zusätzliche Qualitätskontrolle, ein neues mIF-Panel sowie technische Hinweise für die Optimierung zu bewerten, Fehlerbehebung und Entwicklung von neuen Multiplex-Platten, den Labor-Benutzer einrichten und optimieren die mIF-TSA-Methode für benutzerdefinierte mIF Panels zu helfen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die laufenden Krebs-Immuntherapie-Revolution ist Eröffnung Roman und vielversprechende Therapieoptionen für Krebs-Patienten-13. Fortschritte auf dem Gebiet der Immuno-Onkologie erfordert mehr wissen von der entzündlichen Tumor Mikroumgebung, nicht nur, die Biologie der Karzinogenese immunologische Mechanismen zu verstehen, sondern auch für neue Prädiktive Biomarker zu finden Immuntherapie-Behandlungen1,2. Aufgrund der komplexen Biolog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Redaktionelle Betreuung wurde von Deborah Shuman von MedImmune bereitgestellt.
Materials
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient’s response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
- Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
- Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95 (2016).
- Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
- Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
- Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47 (2015).
- Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48 (2018).
- Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
- Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society’s standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
- Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), 16-18 (2016).
- Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223 (2016).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
