Painel de imunofluorescência Multiplex automatizada para estudos imuno-oncologia em amostras de Carcinoma fixada em formol
Summary
Um protocolo detalhado para um painel de seis-marcador multiplex imunofluorescência é otimizado e executado, usando um corante automatizado para resultados mais consistentes e um menor tempo de procedimento. Esta abordagem pode ser adaptada directamente por qualquer laboratório de estudos imuno-oncologia.
Abstract
Evolução contínua em imuno-Oncologia exige uma maior compreensão dos mecanismos da imunologia do câncer. A análise de immunoprofiling de amostras de tecido de biópsias de formalin-fixas, parafina (FFPE) tornou-se uma ferramenta-chave para entender a complexidade da imunologia do tumor e descobrir novos biomarcadores preditivos para imunoterapia. Immunoprofiling análise de tecidos requer a avaliação de marcadores combinadas, incluindo subpopulações de células inflamatórias e imunes, pontos de verificação, o microambiente do tumor. O advento de métodos de imuno-histoquímica multiplex romance permite uma análise mais eficiente Multiparamétrico de seções do tecido único do que o padrão monoplex imuno-histoquímica (IHC). Uma imunofluorescência multiplex comercialmente disponível (se) método é baseado na amplificação do sinal de tyramide e, combinado com a análise microscópica multiespectral, permite uma melhor separação de sinal de diversos marcadores no tecido. Esta metodologia é compatível com o uso de anticorpos primários unconjugated otimizadas para IHC padrão em amostras de tecido FFPE. Neste documento descrevemos detalhadamente um protocolo automatizado que permite multiplex se rotulagem de amostras de tecido de carcinoma, com um painel de seis-marcador anticorpo multiplex compreendendo PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 e citoqueratinas AE1/AE3 com 4, 6-diamidino-2-phenylindole como um corante de contraste nuclear da célula. O protocolo de painel multiplex é otimizado em um corante IHC automatizado para um tempo de coloração que é mais curta que a do protocolo manual e pode ser diretamente aplicado e adaptado por qualquer investigador do laboratório de estudos imuno-oncologia em amostras de tecido humanos FFPE. Também descritos são vários controles e ferramentas, incluindo um método de gota-controle para controle de qualidade fino de um novo painel se multiplex, que são úteis para a otimização e validação da técnica.
Introduction
Immunoprofiling análise de amostras de tecido de tumor FFPE tornou-se um componente essencial de estudos imuno-oncologia, particularmente pela descoberta e validação de novos biomarcadores preditivos para imunoterapia no contexto dos ensaios clínicos1 ,2. IHC cromogênico, usando chromogens químicas tais como diaminobenzidina, continua a ser a técnica padrão no diagnóstica patologia para o immunolabeling de biópsia de tecido3. IHC padrão também pode ser usado para immunoprofiling de tecido de câncer, incluindo a quantificação de subpopulações de linfócitos tumor-associado e a avaliação dos níveis de expressão de pontos de verificação imunes como ligante de morte celular programada 1 (PD-L1)4 ,5. IHC padrão é limitada, no entanto, em que apenas um antígeno pode ser rotulado por seção de tecido. Immunoprofiling estudos normalmente requer a análise da expressão combinada de vários marcadores, o uso do IHC padrão exigiria a coloração das várias secções de tecido, cada uma manchada com um marcador único e, portanto, seria substancialmente limitado para a análise de amostras de tecido pequenas tais como biopsias de agulha. Métodos padrão de IHC também são limitados para a avaliação de marcadores que são coexpressed por populações de diversas células, como é comum com marcadores de ponto de verificação imune como PD-L1, que é expressa pelo tumor-associado de macrófagos e células cancerosas. Essa limitação tem sido relatada em, por exemplo, o uso do padrão monoplex IHC por patologistas para análise quantitativa de um marcador IHC expressado pela célula diversos tipos6. O desenvolvimento de técnicas IHC cromogênico multiplex empregando diversas chromogens coloridas sobre o mesmo tecido seção representa um avanço sobre o método padrão de IHC monoplex,7 embora permaneçam limitados pelo immunolabeling de poucos marcadores e também apresentar um desafio técnico importante para a avaliação adequada dos marcadores expressado nos compartimentos subcellular mesmos das mesmas populações de células.
Os detalhes acima mencionados sobre a disponibilidade de tecido de amostras clínicas, bem como as limitações das técnicas IHC cromogênica multiplex, deram origem à necessidade de desenvolver métodos aperfeiçoados de multiplex imuno-Oncologia estudos baseados em etiquetando fluorescente combinado com sistemas que podem efetivamente separar os sinais de vários fluorophores mesmo slide de imagens. Uma tal técnica é baseada na amplificação do sinal de tyramide (TSA) combinada com imagens multiespectrais de microscopia para cor eficiente separação8. Um kit comercialmente disponível com base em TSA emprega fluorophores otimizado para geração de imagens multiespectrais8 (ver Tabela de materiais). Uma vantagem importante deste sistema é a sua compatibilidade com os anticorpos primários sem rótulo mesmos que já tenham sido validados e otimizado para padrão cromogênico IHC9,10,11. Isto permite não só a otimização mais rápida, mas também a flexibilidade nas modificações de otimização e painel incorporando novos destinos. Além disso, o método TSA multiplex imunofluorescência (mIF) pode ser otimizado para comercialmente disponíveis sistemas automatizados de corante IHC, permitindo para uma simples transferência de monoplex cromogênico IHC a mIF.
Aqui nós apresentamos um protocolo para um painel do Fumin para estudos imuno-Oncologia baseado em automatizada do Fumin TSA coloração e usa um scanner multi-espectral para a imagem latente. Este protocolo pode ser adaptado e modificado por qualquer usuário do laboratório com acesso à instrumentação descrita e reagentes. O protocolo inclui um painel de seis anticorpos primários para o immunoprofiling de carcinomas: PD-L1, PD-1, CD68 (como um marcador de pan-macrófago), CD8 (células T citotóxicas), Ki-67 e AE1/AE3 (pancitoqueratina, usado como um marcador epitelial para a identificação de células de carcinoma). Um estudo recente descreve a otimização de um protocolo de mIF TSA manual usando IHC cromogênico como um padrão de referência para validar os cinemas coloração12. O método atualizado aqui apresentado foi desenvolvido usando um kit TSA comercialmente disponível, sete cores otimizado em um corante automatizado, drasticamente, encurtando o tempo coloração de 3 – 5 dias para 14 h, melhorando também a consistência da coloração. Além do protocolo principal detalhado apresentado aqui, uma seção de Materiais complementares inclui o método de “gota-control”, um processo de controle de qualidade adicional para avaliar um novo painel de mIF, bem como notas técnicas de otimização, solução de problemas e desenvolvimento de novos painéis multiplex para ajudar o usuário de laboratório para configurar e otimizar o método TSA do Fumin para painéis personalizados do Fumin.
Protocol
Representative Results
Discussion
A revolução de imunoterapia do câncer em curso é o romance de abertura e prometendo opções terapêuticas para pacientes de câncer13. Avanços no campo da imuno-Oncologia exigirá maior conhecimento do microambiente do tumor inflamatório, não só para compreender a biologia dos mecanismos imunológicos envolvidos na carcinogênese, mas também para encontrar biomarcadores preditivos de novo tratamentos baseados em imunoterapia1,2. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apoio editorial foi fornecido por Deborah Shuman da MedImmune.
Materials
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient’s response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
- Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
- Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95 (2016).
- Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
- Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
- Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47 (2015).
- Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48 (2018).
- Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
- Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society’s standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
- Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), 16-18 (2016).
- Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223 (2016).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
