स्वचालित मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस इंयूनो के लिए पैनल-Formalin पर ऑन्कोलॉजी अध्ययन-फिक्स्ड कार्सिनोमा ऊतक नमूनों
Summary
एक छह मार्कर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस पैनल के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल अनुकूलित और प्रदर्शन किया है, और अधिक सुसंगत परिणाम और एक छोटी प्रक्रिया समय के लिए एक स्वचालित दाग का उपयोग कर । यह दृष्टिकोण सीधे इंयूनो-ऑन्कोलॉजी अध्ययन के लिए किसी भी प्रयोगशाला द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है ।
Abstract
इंयूनो में जारी घटनाक्रम-ऑन्कोलॉजी कैंसर इम्यूनोलॉजी के तंत्र की एक वृद्धि की समझ की आवश्यकता होती है । formalin से ऊतक के नमूनों के immunoprofiling विश्लेषण-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (FFPE) बायोप्सी ट्यूमर इम्यूनोलॉजी की जटिलता को समझने और कैंसर immunotherapy के लिए उपंयास पूर्वानुमानात्मक अचिह्नकों की खोज के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है । ऊतकों के Immunoprofiling विश्लेषण ट्यूमर microenvironment में, भड़काऊ कोशिका उपआबादी और प्रतिरक्षा चौकियों सहित संयुक्त मार्करों के मूल्यांकन की आवश्यकता है । उपंयास मल्टीप्लेक्स immunohistochemical तरीकों का आगमन एकल ऊतक वर्गों के एक अधिक कुशल multiparametric विश्लेषण के लिए अनुमति देता है से मानक monoplex immunohistochemistry (आइएचसी) करता है । एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस (IF) विधि tyramide-संकेत प्रवर्धन पर आधारित है और, multispectral सूक्ष्म विश्लेषण के साथ संयुक्त, ऊतक में विविध मार्कर के एक बेहतर संकेत जुदाई के लिए अनुमति देता है । इस पद्धति unconjugated प्राथमिक एंटीबॉडी कि FFPE ऊतक नमूनों पर मानक आइएचसी के लिए अनुकूलित किया गया है के उपयोग के साथ संगत है । इस के साथ हम विस्तार से एक स्वचालित प्रोटोकॉल है कि मल्टीप्लेक्स की अनुमति देता है अगर कार्सिनोमा ऊतक नमूनों की एक छह मार्कर मल्टीप्लेक्स एंटीबॉडी पीडी-L1 शामिल पैनल के साथ लेबल का वर्णन, पीडी-1, CD68, सीडी 8, Ki-६७, and AE1/AE3 cytokeratins विथ 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole के रूप में एक परमाणु सेल counterstain । मल्टीप्लेक्स पैनल प्रोटोकॉल एक धुंधला समय है कि मैनुअल प्रोटोकॉल की तुलना में कम है और सीधे लागू किया जा सकता है और मानव FFPE ऊतक नमूनों पर इंयूनो-ऑन्कोलॉजी अध्ययन के लिए किसी भी प्रयोगशाला अन्वेषक द्वारा अनुकूलित करने के लिए एक स्वचालित आइएचसी दाग में अनुकूलित है । यह भी वर्णित कई नियंत्रण और उपकरण, एक नया मल्टीप्लेक्स के ठीक गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक बूंद नियंत्रण विधि सहित अगर पैनल, कि अनुकूलन और तकनीक के सत्यापन के लिए उपयोगी होते हैं ।
Introduction
FFPE ट्यूमर ऊतक नमूनों के Immunoprofiling विश्लेषण नैदानिक परीक्षण 1 के संदर्भ में कैंसर immunotherapy के लिए उपंयास पूर्वानुमानात्मक मार्क्स की खोज और सत्यापन के लिए विशेष रूप से इंयूनो-ऑन्कोलॉजी अध्ययन का एक अनिवार्य घटक बन गया है ,2. Chromogenic आइएचसी, diaminobenzidine के रूप में रासायनिक chromogens का उपयोग, बायोप्सी ऊतक के immunolabeling के लिए नैदानिक विकृति में मानक तकनीक रहता है3. मानक आइएचसी कैंसर ऊतक immunoprofiling के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है, ट्यूमर से संबंधित लिम्फोसाइटों की उपजनसंख्या के quantitation और जैसे क्रमादेशित सेल मौत ligand 1 (पीडी-L1) 4 प्रतिरक्षा चौकियों के अभिव्यक्ति स्तर के आकलन सहित ,5. मानक आइएचसी सीमित है, हालांकि, में है कि केवल एक प्रतिजन ऊतक अनुभाग प्रति लेबल किया जा सकता है । क्योंकि immunoprofiling अध्ययन आमतौर पर कई मार्करों के संयुक्त अभिव्यक्ति के विश्लेषण की आवश्यकता होती है, मानक आइएचसी का उपयोग कई ऊतक वर्गों के धुंधला की आवश्यकता होगी, एक एक मार्कर के साथ सना हुआ, और इसलिए होगा, इस तरह के कोर सुई बायोप्सी के रूप में छोटे ऊतक नमूनों के विश्लेषण के लिए काफी सीमित. मानक आइएचसी तरीके भी विभिंन कोशिका आबादी द्वारा coexpressed है कि मार्करों के आकलन के लिए सीमित हैं, जैसे पीडी-L1, जो दोनों ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज और कैंसर की कोशिकाओं द्वारा व्यक्त की है के रूप में प्रतिरक्षा चौकी मार्करों के साथ आम है । इस सीमा में सूचित किया गया है, उदाहरण के लिए, एक आइएचसी मार्कर के विविध सेल प्रकार द्वारा व्यक्त की मात्रात्मक विश्लेषण के लिए पैथोलॉजिस्ट द्वारा मानक monoplex आइएचसी का उपयोग6. मल्टीप्लेक्स chromogenic आइएचसी तकनीक का विकास एक ही ऊतक खंड पर विविध रंग chromogens रोजगार मानक आइएचसी monoplex विधि पर एक उंनति का प्रतिनिधित्व करता है,7 हालांकि वे सिर्फ कुछ के immunolabeling द्वारा सीमित रह मार्करों और भी एक ही सेल आबादी के एक ही उपसेलुलर डिब्बों में व्यक्त मार्करों के उचित मूल्यांकन के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौती मौजूद ।
नैदानिक नमूनों से ऊतक की उपलब्धता के बारे में aforementioned निरंतर, साथ ही मल्टीप्लेक्स chromogenic आइएचसी तकनीकों की सीमाओं, के आधार पर इंयूनो-ऑन्कोलॉजी अध्ययन के लिए बेहतर मल्टीप्लेक्स तरीकों विकसित करने की आवश्यकता को जंम दिया है फ्लोरोसेंट इमेजिंग सिस्टम है कि प्रभावी ढंग से एक ही स्लाइड से एकाधिक fluorophores के संकेतों को अलग कर सकते है के साथ संयुक्त लेबलिंग । ऐसा ही एक तकनीक tyramide संकेत प्रवर्धन (TSA) कुशल रंग जुदाई8के लिए multispectral माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ संयुक्त पर आधारित है । एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध TSA-आधारित किट fluorophores multispectral इमेजिंग8 के लिए अनुकूलित ( सामग्री की तालिकादेखें) कार्यरत हैं । इस प्रणाली का एक महत्वपूर्ण लाभ है कि पहले से ही मांय है और मानक chromogenic आइएचसी9,10,11के लिए अनुकूलित किया गया है कि एक ही अनलेबल प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ अपनी अनुकूलता है । यह न केवल तेजी से अनुकूलन पर भी अनुकूलन और पैनल नए लक्ष्यों को शामिल संशोधनों में लचीलापन की अनुमति देता है । इसके अलावा, मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस (mIF) TSA विधि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्वचालित आइएचसी दाग प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, monoplex chromogenic आइएचसी से mIF के लिए एक सीधा हस्तांतरण के लिए अनुमति देता है ।
यहां हम इंयूनो-ऑन्कोलॉजी अध्ययन है कि स्वचालित mIF TSA धुंधला पर आधारित है और इमेजिंग के लिए एक multispectral स्कैनर का उपयोग करता है के लिए एक mIF पैनल के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद । इस प्रोटोकॉल और अनुकूलित किया जा सकता है वर्णित इंस्ट्रूमेंटेशन और रिएजेंट के लिए उपयोग के साथ किसी भी प्रयोगशाला उपयोगकर्ता द्वारा संशोधित । प्रोटोकॉल कार्सिनोमा के immunoprofiling के लिए छह प्राथमिक एंटीबॉडी के एक पैनल में शामिल हैं: पीडी-L1, पीडी-1, CD68 (एक पान-मैक्रोफेज मार्कर के रूप में), सीडी 8 (टी साइटोटोक्सिक कोशिकाओं), Ki-६७, और AE1/AE3 (पान cytokeratin, की पहचान के लिए एक उपकला मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया कार्सिनोमा कोशिकाओं) । एक ताजा अध्ययन एक मानक संदर्भ के रूप में chromogenic आइएचसी का उपयोग करके एक मैनुअल TSA mIF प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए मल्टीप्लेक्स धुंधला12मांय का वर्णन करता है । अद्यतन विधि यहां प्रस्तुत एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, सात रंग TSA एक स्वचालित दाग में अनुकूलित किट का उपयोग करके विकसित किया गया है, तेजी से 3 से धुंधला समय छोटा-5 दिन से 14 घंटे, जबकि भी धुंधला की निरंतरता में सुधार । विस्तृत मुख्य यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अलावा, एक पूरक सामग्री अनुभाग “ड्रॉप नियंत्रण विधि”, एक अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रिया के लिए एक नया mIF पैनल, साथ ही अनुकूलन के लिए तकनीकी नोटों का मूल्यांकन भी शामिल है, समस्या निवारण, और नए मल्टीप्लेक्स पैनलों के विकास के लिए प्रयोगशाला उपयोगकर्ता की स्थापना की मदद और अनुकूलित mIF पैनलों के लिए mIF TSA विधि का अनुकूलन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
चल रहे कैंसर immunotherapy क्रांति उपंयास खोल रहा है और कैंसर रोगियों के लिए चिकित्सकीय विकल्प का वादा13। इंयूनो के क्षेत्र में अग्रिम-ऑन्कोलॉजी भड़काऊ ट्यूमर microenvironment की वृद्धि हुई ज्ञान की आवश्यकता हो…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
संपादकीय समर्थन MedImmune के दबोरा शुमन द्वारा प्रदान की गई थी ।
Materials
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
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