Automatiserad Multiplex immunofluorescens Panel för immunonkologiska studier på Formalin-fasta Carcinoma vävnadsprover
Summary
Ett detaljerat protokoll för en sex-markör multiplex immunofluorescens panel är optimerad och utfört, med en automatiserad stainer för mer enhetliga resultat och en kortare procedur. Detta tillvägagångssätt kan anpassas direkt vid ett laboratorium för immunonkologiska studier.
Abstract
Fortsatta utvecklingen i immunonkologiska kräver en ökad förståelse för mekanismerna bakom cancerimmunologi. Immunoprofiling analys av vävnadsprov från formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) biopsier har blivit ett viktigt verktyg för att förstå komplexiteten i tumör immunologi och upptäcka nya Prediktiva biomarkörer för cancer immunoterapi. Immunoprofiling analys av vävnader kräver utvärdering av kombinerade markörer, inklusive inflammatoriska celler subpopulationer och immun kontrollpunkter, i den tumör mikromiljö. Tillkomsten av nya multiplex immunohistokemiska metoder möjliggör en effektivare multiparametric analys av enstaka vävnadssnitt än standard monoplex immunhistokemi (IHC). En kommersiellt tillgänglig multiplex immunofluorescens möjliggör (om) metoden baseras på tyramide-signal förstärkning och, i kombination med Multispektrala Mikroskopisk analys, en bättre signal separation av olika markörer i vävnad. Denna metod är förenlig med användningen av okonjugerat primära antikroppar som har optimerats för standard IHC på FFPE vävnadsprover. Häri beskriver vi i detalj en automatiserad protokoll som tillåter multiplex om märkning av carcinoma vävnadsprover med en sex-markör multiplex antikropp panel bestående av PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 och AE1/AE3 typen med 4, 6-diamidin-2-fenylindol som en nukleär cell motfärg. Multiplex panel protokollet är optimerad i en automatiserad IHC stainer för en färgning tid som är kortare än den manuella protokollet och kan direkt tillämpas och anpassas av alla laboratorium utredare för immunonkologiska studier på mänskliga FFPE vävnadsprover. Här beskrivs också flera kontroller och verktyg, inklusive en droppe-kontroll metod för fina kvalitetskontroll av en ny multiplex om panel, som är användbara för optimering och validering av teknik.
Introduction
Immunoprofiling analys av FFPE tumör vävnadsprover har blivit en viktig del av immunonkologiska studier, särskilt för identifiering och validering av nya Prediktiva biomarkörer för immunterapi mot cancer inom ramen för kliniska prövningar1 ,2. Kromogen IHC, använda kemiska kromogener såsom Diaminobenzidin, förblir standardteknik i Diagnostisk patologi för immunolabeling biopsi vävnad3. Standard IHC kan också användas för cancer vävnad immunoprofiling, inklusive kvantitering av subpopulationer av tumör-associerad lymfocyter och bedömningen av uttrycksnivåerna för immun kontrollpunkter såsom programmerad cell death ligand 1 (PD-L1)4 ,5. Standard IHC är begränsad, men däri endast en antigen kan märkas per vävnad avsnitt. Eftersom immunoprofiling studier kräver normalt analys av kombinerade uttryck av flera markörer, användning av standard IHC skulle kräva färgningen av flera vävnadssnitt, varje färgas med en enda markör, och skulle därför vara väsentligt begränsad för analys av små vävnadsprover såsom nålbiopsi. IHC standardmetoder begränsas också för bedömningen av markörer som är coexpressed av olika cellpopulationer, vilket är vanligt med immun kontrollpunkt markörer såsom PD-L1, som uttrycks av både tumör-associerad makrofager och cancerceller. Denna begränsning har rapporterats i, exempelvis användningen av standard monoplex IHC av patologer för kvantitativ analys av en IHC markör uttryckts av olika cell typ6. Utvecklingen av multiplex kromogen IHC tekniker sysselsätter olika färgade kromogener på de samma vävnad avsnitt representerar en befordran över IHC monoplex standardmetoden,7 även om de fortfarande begränsas av immunolabeling av bara några markörer och även presentera en viktig teknisk utmaning för ordentlig utvärdering av markörer som uttrycks i de samma subcellulär fack i de samma cellpopulationer.
De ovan nämnda förbehåll angående vävnad tillgänglighet från kliniska prover, samt begränsningar i multiplex kromogen IHC tekniker, har gett upphov till behovet av att utveckla förbättrade multiplex metoder för immunonkologiska studier baserade på fluorescerande märkning kombinerat med imaging system som effektivt kan skilja signaler från flera fluorophores från samma bild. En sådan teknik är baserad på tyramide signal amplifiering (TSA) i kombination med Multispektrala mikroskopi imaging för effektiv färg separation8. Ett kommersiellt tillgängliga TSA-baserade kit sysselsätter fluorophores optimerad för Multispektral avbildning8 (se Tabell för material). En viktig fördel med detta system är dess förenlighet med de samma omärkt primära antikroppar som redan har validerats och optimerad för standard kromogen IHC9,10,11. Detta tillåter inte bara snabbare optimering men också flexibilitet i optimering och panelen ändringarna införliva nya mål. Dessutom metoden multiplex immunofluorescens (mIF) TSA kan optimeras för kommersiellt tillgängliga automatiserade IHC stainer system, möjliggör en enkel överföring från monoplex kromogen IHC till mIF.
Här presenterar vi ett protokoll för en mIF panel för immunonkologiska studier som är baserade på automatiserade mIF TSA färgning och använder en Multispektrala scanner för avbildning. Detta protokoll kan anpassas och modifieras av alla laboratorium användare med tillgång till de beskrivna instrumentering och reagenser. Protokollet innehåller en panel av sex primära antikroppar för immunoprofiling av Carcinom: PD-L1, PD-1, CD68 (som pan-makrofag markör), CD8 (T-cytotoxiska celler), Ki-67 och AE1/AE3 (pan-cytokeratin, används som en epitelial markör för identifiering av Carcinom celler). En nyligen genomförd studie beskriver optimering av en manuell TSA mIF protokoll med kromogent IHC som standard referens för att validera den multiplex färgning12. Den uppdatera metod som presenteras här har utvecklats med hjälp av en kommersiellt tillgänglig, sju-färg TSA kit optimerad i en automatiserad stainer, drastiskt förkorta färgning tiden från 3 – 5 dagar till 14 h, samtidigt förbättra konsekvensen av färgningen. Förutom detaljerade huvudsakliga protokollet presenteras här, omfattar ett Kompletterande material avsnitt metoden ”drop-control”, en ytterligare kvalitetskontroll process för att utvärdera en ny mIF-panel, liksom tekniska noteringar för optimering, Felsökning och utvecklingen av nya multiplex paneler att hjälpa laboratorium användaren att ställa in och optimera metoden mIF TSA för anpassade mIF paneler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pågående cancer immunoterapi revolutionen är öppningen roman och lovande behandlingsalternativ för cancer patienter13. Framsteg inom området för immunonkologiska kommer att kräva ökad kunskap om den inflammatoriska tumör mikromiljö, inte bara för att förstå biologin av de immunologiska mekanismerna som är involverade i carcinogenes, men också för att hitta Prediktiva biomarkörer för nya immunterapi-baserade behandlingar1,2</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Redaktionellt stöd tillhandahölls av Deborah Shuman av MedImmune.
Materials
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient’s response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
- Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
- Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95 (2016).
- Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
- Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
- Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47 (2015).
- Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48 (2018).
- Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
- Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society’s standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
- Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), 16-18 (2016).
- Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223 (2016).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
