بروتوكول شكلي للتقييم الموضوعي للسلوك الكيسة أثناء التزجيج والخطوات الاحترار
Summary
وهنا يقدم بروتوكول الوقت الفاصل بين شكلي لمتابعة كثافة انكماش الكيسة والتوسع في الطاقة المتجددة خلال التدخلات بريفيتريفيكيشن والانتعاش بعد انتهاء الاحترار. من الممكن في مختبرات الإخصاب في المختبر مجهزة بالمجاهر الوقت الفاصل بين تطبيق البروتوكول ويوصي بتطوير طريقة التزجيج الكيسة الأمثل.
Abstract
توضح هذه المقالة طريقة noninvasive الكيسة مورفوميتري استناداً إلى الوقت الفاصل بين التصوير الميكروفيلمي للرصد الدقيق لحجم الكيسة تغيير خلال المراحل الفردية قبل وبعد عمليات التزجيج. يمكن أن تكون الطريقة مفيدة في البحث عن توقيت المثلى الكيسة التعرض لتركيزات مختلفة من المنتجة عن طريق مراقبة انكماش الكيسة وإعادة-التوسع في مختلف قبل والتزجيج بعد انتهاء مراحل. يمكن أن يكون الأمثل مع هذه المنهجية، البروتوكول التزجيج الكيسة. لمظهر أفضل من فائدة هذا الأسلوب شكلي، تتم مقارنة البروتوكولين إعداد الكيسة مختلفة التزجيج؛ واحد مع استخدام blastocoel اصطناعية الانهيار وآخر دون هذا التدخل قبل التزجيج. كل التغييرات في الحجم blastocysts متبوعاً بالوقت الفاصل بين التصوير الميكروفيلمي ويقاس بأدوات برامج تحرير الصور. يتم أخذ القياسات كل 20 ثانية في مراحل بريفيتريفيكيشن وكل 5 دقائق في فترة ما بعد الاحترار. يتم عرض التغييرات أبعاد الكيسة كل وحدة وقت رسومياً في الرسومات التخطيطية لخط. وتبين النتائج مرحلة بريفيتريفيكيشن الموازنة طويلة فيها الكيسة سليمة ينكمش أولاً وثم ببطء الغيارات blastocoel، دخول التزجيج مع blastocoel مملوءة بسائل. الكيسة أنهار مصطنع لا يزال في مرحلته منكمش يمر بمرحلة الموازنة كاملة. وخلال مرحلة التزجيج، أيضا لا يتغير حجمه. حيث يظهر مورفوميتري الكيسة حجم ثابت من blastocysts مصطنع أنهار خلال الخطوة بريفيتريفيكيشن، ويبدو أن هذه المرحلة يمكن أن يكون أقصر. وينص البروتوكول على وصف العديد من معلمات إضافية النسبية للسلوك الكيسة أثناء وبعد تجميد بناء على سرعة وكثافة التغييرات في الحجم، وعدد تقلصات blastocoel الجزئي أو الكلي الكيسة ينهار، والوقت إجمالي blastocoel re-توسع أو الوقت الفقس.
Introduction
تجميد الأجنة البشرية برييمبلانتيشن من برنامج الإخصاب في الأنابيب (التلقيح الصناعي) في الوقت الحاضر ممارسة روتينية في معظم مختبرات التلقيح الاصطناعي. الجنين بطيء تجميد الأسلوب بدأ استخدامها سريرياً في عام 1985، مع إدخال المنتجة محددة والمجمدات الكمبيوتر التي تسيطر عليها، مما مكن التبريد التي تسيطر عليها من الأجنة وصولاً إلى-7 درجة مئوية، وعندما حملت نويات الثلج (البذور) في المحيطة كريوبروتيكتيفي متوسطة1. بالتبريد المستمر، أن ينمو بلورات الثلج، مما تسبب في هايبروسمولاليتي الكسر السائل المتبقية، وبالتالي فالجفاف وتقلص الخلايا الجنينية. -30 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية، أن سقطت الأجنة في النيتروجين السائل لتخزين أطول. ويمكن ملاحظة ما كان يحدث مع أجنة أو بويضات أثناء التبريد فقط بواسطة كريوميكروسكوبيس المكيفة خصيصا، مما ساعد على تحسين البروتوكولات للواسمات2. تجميد بلاستوسيستس، زيادة حجم والمرحلة الجنينية أكثر الوارد من السوائل، أعطت نتائج سريرية أقل واعدة في تلك الأيام3.
الاختراق في نعد الكيسة هو الأخذ بأسلوب التزجيج، التي جرت جفاف الخلايا قبل التبريد باستخدام تركيزات عالية من المنتجة4. كما يمكن إزالة السائل من بلاستوكويل قبل التزجيج بجعل افتتاح ميكانيكية بين اثنين من الخلايا تروفيكتوديرم5. على الرغم من أن معدل بقاء الكيسة الفورية بعد التزجيج والاحترار فوق 90%، وفيما يلي النتائج السريرية نقل الكيسة الشركة إنتاج حرارة في تجويف الرحم مماثل تقريبا للنتائج بعد نقل جديدة الأجنة، هذا الأسلوب للواسمات لم الموحدة6،7حتى الآن. بروتوكولات التزجيج تختلف وفقا لنوع (أ) وتركيز المنتجة، (ب) عدد الخطوات بريفيتريفيكيشن، (ج) مدة الخطوات الفردية، (د) استخدام blastocoel الاصطناعية الانهيار قبل التزجيج أو لا، (ه). انهيار الطرق والمرحلة (و) التوسع في الكيسة (ز) الموازنة/التزجيج درجة الحرارة في الأجنة التي ينبغي أن تكون الشركة إنتاج8. منذ المنتجة يمكن أن تكون سامة للخلايا، وقد الكيسة وقت التعرض لهذه الحلول لتكون واضحة المعالم. بيد أن بعض الشركات المصنعة لوسائل الإعلام نعد تسمح البروتوكولات مرنة جداً.
وتركز اهتمام العلماء عادة على دراسة إمكانية التوسع في إعادة الكيسة بهدف البحث عن المؤشرات الحيوية الجديدة مع تنبؤ أفضل من غرس6،،من910. كيف يذوي blastocysts البشرية في مختلف خطوات إضافة المنتجة قبل التزجيج وما يحدث مع blastocysts بعد التزجيج والاحترار، المنتجة عندما يكون المراد إزالتها من الخلايا، وكيف بلاستوسيستس ترطيب و إعادة توسيع بعد الاحترار، وهو ليس على ما يرام ووصف لا يفهم. تطوير منهجية لتحقيق الهدف ورصد كمياً للسلوك الكيسة أثناء الخطوات المختلفة للواسمات هو، وبالتالي، الأساس المنطقي.
مع مرور الزمن مجاهر من مختلف الشركات المصنعة، من الممكن الآن لرصد سلوك الكيسة في مرحلة ما قبل ومراحل ما بعد انتهاء عمليات التزجيج. بها بما في ذلك أدوات حاسوبية إضافية، يمكن أيضا إجراء قياسات لحجمها (مورفوميتري). قياس الانخفاض أو زيادة في حجم الجنين في وقت معين، فمن الممكن لدورهن تقييم مورفوديناميكس للأجنة أثناء الجفاف والإماهة.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول لمراقبة مورفوديناميكس الكيسة أثناء وبعد تجميد يمكن أيضا تنفذ باستخدام أدوات البرمجيات من الشركات المصنعة الأخرى والصكوك المماثلة. الوقت الفاصل بين أنظمة معدلة لعلم الأجنة السماح بالرصد المستمر للتنمية الجنين. وكان الغرض من هذا العمل لإدخال التحديد الكمي للسلوك الكيسة أثناء إع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل جزء من برنامج P3-0327 والبحث المشروع البحثي J3-7177، تأسست على يد “مؤسسة البحوث السلوفيني”.
Materials
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming – a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
