Morfometrische Protocol voor de objectieve beoordeling van de Blastocyst gedrag tijdens verglazing en opwarming van de aarde stappen
Summary
Hier presenteren we een time-lapse Morfometrische protocol te volgen van de intensiteit van de blastocyst krimp en re-expansie tijdens previtrification interventies en na opwarming van de aarde herstel. De toepassing van het protocol is mogelijk in in vitro bevruchting laboratoria die toegerust zijn met time-lapse microscopen en wordt aanbevolen bij de ontwikkeling van een optimale blastocyst verglazing methode.
Abstract
Dit artikel beschrijft de noninvasive methode van de blastocyst morphometry op basis van time-lapse microphotography voor de nauwkeurige controle van de een blastocyst volume wijzigen tijdens de afzonderlijke fasen vóór en na de verglazing. De methode kan zinvol zijn in het zoeken naar de meest optimale timing van de blastocyst blootstelling aan verschillende concentraties van cryoprotectant door het observeren van de blastocyst krimp en re-expansie in verschillende pre en post verglazing fasen. Met deze methode, kan het blastocyst verglazing protocol worden geoptimaliseerd. Voor een betere demonstratie van het nut van deze Morfometrische-methode, worden twee verschillende blastocyst voorbereiding protocollen voor verglazing vergeleken; één met het gebruik van een kunstmatige blastocoel samenvouwen en één zonder deze interventie voordat verglazing. Zowel de veranderingen van het volume van de blastocysten worden gevolgd door time-lapse microphotography gemeten door foto-editing softwaretools. De metingen zijn verricht elke 20 seconden in fasen van previtrification en elke 5 minuten gedurende de post opwarming van de aarde. De veranderingen van de afmetingen van de blastocyst per tijdseenheid worden weergegeven als geïllustreerd in lijn diagrammen. De resultaten tonen een lange evenwichtsinstelling previtrification fase waarin de intact blastocyst eerst krimpt en vervolgens langzaam vullingen de blastocoel, invoeren van verglazing met een vloeistof gevulde blastocoel. De kunstmatig samengevouwen blastocyst blijft in zijn gekrompen stadium door de gehele evenwichtsinstelling fase. Tijdens de fase van de verglazing verandert het ook niet haar volume. Aangezien de blastocyst morphometry een constant volume van het kunstmatig samengevouwen blastocysten tijdens de stap van de previtrification toont, het lijkt erop dat dit stadium kan korter. Het beschreven protocol biedt vele extra vergelijkende parameters van de blastocyst gedrag tijdens en na de cryopreservatie op basis van de snelheid en de intensiteit van de veranderingen van het volume, het aantal gedeeltelijke blastocoel contracties of totale blastocyst stort en de tijd tot een totale blastocoel re-uitbreiding of tot broedeieren.
Introduction
Cryopreservatie van embryo voor inplanting van het in vitro bevruchting programma (IVF) is tegenwoordig een gangbare praktijk in de meeste IVF-laboratoria. Het langzame embryo bevriezing van de methode begon te worden klinisch gebruikt in 1985, met de introductie van specifieke cryoprotectant en computergestuurde diepvriezers, waardoor de gecontroleerde koeling van embryo’s tot-7 ° C, wanneer het ijs nucleatie (zaaien) was geïnduceerd in de omliggende cryoprotective middellange1. Door continue afkoeling, de ijskristallen zou groeien, waardoor de hyperosmolality van de resterende vloeibare fractie en, bijgevolg, de uitdroging en krimp van de embryonale stamcellen. Bij-30 ° C of -80 ° C, zou de embryo’s worden ondergedompeld in de vloeibare stikstof voor langere opslag. Wat er met de embryo’s of eicellen gebeurde tijdens de koeling kan alleen door speciaal aangepast cryomicroscopes, die heeft bijgedragen tot het verbeteren van cryopreservatie protocollen2worden nageleefd. Het invriezen van blastocysten, een hogere volumes en meer vloeistof-bevatte embryonale stadium, gaf minder veelbelovende klinische resultaten in die dagen3.
De doorbraak in de cryopreservatie van de blastocyst was de introductie van de verglazing methode, waar de uitdroging van de cellen plaatsgevonden heeft voordat u te koelen met behulp van hoge concentraties van cryoprotectant4. De verwijdering van de vloeistof uit de blastocoel vóór verglazing kan ook worden bereikt door het maken van een mechanische opening tussen twee trophectoderm cellen5. Hoewel de overlevingskansen van de onmiddellijke blastocyst na de verglazing en opwarming van de aarde hoger is dan 90%, en de klinische uitkomst na is de overdracht van de blastocyst verglaasd/opgewarmd in de baarmoederholte bijna vergelijkbaar met resultaten na de overdracht van de vers embryo’s, deze methode cryopreservatie is nog geen gestandaardiseerde6,7. Verglazing protocollen, is afhankelijk van (a) de aard en de concentratie van de cryoprotectant, (b) het aantal previtrification stappen, (c) de duur van afzonderlijke stappen, (d) het gebruik van een kunstmatige blastocoel samen te vouwen voordat verglazing of niet, (e). instortende methoden, (f) de uitbreiding van de blastocyst stadium en (g) de evenwichtsinstelling/verglazing temperatuur op die de embryo’s moet verglaasd8. Aangezien cryoprotectant kunnen giftig voor de cellen, moet de blastocyst blootstellingstijd om deze oplossingen goed worden gedefinieerd. Echter, sommige cryopreservatie media fabrikanten zeer flexibel protocollen.
De belangstelling van wetenschappers is meestal gericht op het bestuderen van de blastocyst re-uitbreiding capaciteit met het oog op het vinden van nieuwe biomarkers met een betere voorspelling van implantatie6,9,10. Hoe menselijke blastocysten bij de verschillende stappen uitdrogen van het toevoegen van cryoprotectant voordat verglazing en wat gebeurt er met blastocysten na verglazing en opwarming van de aarde, als cryoprotectant moeten worden verwijderd uit de cellen, en hoe de blastocysten hydrateren en opnieuw uitbreiden na de opwarming van de aarde, is niet goed beschreven noch begrepen. De ontwikkeling van een methodologie voor de objectieve en gekwantificeerde controle van blastocyst gedrag tijdens verschillende cryopreservatie stappen is dus reden.
Met time-lapse microscopen van verschillende fabrikanten is het nu mogelijk om te controleren van het gedrag van de blastocyst in pre en post verglazing fasen. Door extra informatica-instrumenten, kunnen metingen van hun grootte (morphometry) ook worden uitgevoerd. Door het meten van de afname of toename in grootte van de embryo’s op een bepaald moment, is het mogelijk te objectiveren van de beoordeling van de morfodynamiek van embryo’s tijdens dehydratie en rehydratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol voor de observatie van de blastocyst morfodynamica tijdens en na cryopreservatie kan ook worden uitgevoerd met behulp van soortgelijke instrumenten en softwarehulpmiddelen van andere fabrikanten. Time-lapse systemen aangepast voor embryologie toestaan de continue monitoring van embryo-ontwikkeling. Het doel van dit werk was de introductie van de kwantificering van de blastocyst gedrag tijdens de voorbereiding van blastocysten voor verglazing en na hun opwarming van de aarde. Dit werd gedaan door de objectiev…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk is een onderdeel van programma P3-0327 en onderzoek onderzoeksproject J3-7177, opgericht door de Sloveense Research Foundation.
Materials
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming – a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
