Summary
Qui presentiamo un protocollo time-lapse morfometrica per seguire l'intensità della contrazione di blastocisti e re-espansione durante gli interventi di previtrification ed il recupero post-riscaldamento. L'applicazione del protocollo è possibile in vitro fertilizzazione laboratori attrezzati con microscopi time-lapse e raccomanda lo sviluppo di un metodo di vitrificazione blastocisti ottimale.
Abstract
Questo articolo viene descritto il metodo non invasivo di blastocisti morfometria basata su Time-lapse microfotografia per il monitoraggio accurato del volume di una blastocisti cambiando durante diverse fasi prima e dopo la vitrificazione. Il metodo può essere utile nella ricerca per la tempistica ottima di esposizione di blastocisti a diverse concentrazioni di crioprotettori osservando restringimento di blastocisti e re-espansione in diversi pre- e post-vetrificazione fasi. Con questa metodologia, il protocollo di vetrificazione di blastocisti può essere ottimizzato. Per una migliore dimostrazione dell'utilità di questo metodo morfometrico, vengono confrontati due protocolli di preparazione diversi blastocisti per la vitrificazione; uno con l'utilizzo di un artificiale Blastocele crollando e uno senza questo intervento prima di vetrificazione. Entrambe le variazioni di volume dei blastocisti sono seguite da Time-lapse microfotografia e misurate dagli strumenti software di fotoritocco. Le misurazioni sono effettuate ogni 20 secondi in fasi di previtrification e ogni 5 minuti nel periodo post-riscaldamento. I cambiamenti delle dimensioni blastocisti per unità di tempo sono presentati graficamente nei diagrammi di linea. I risultati mostrano una fase di previtrification di equilibrazione lungo in cui la blastocisti intatta prima si restringe e poi lentamente ricariche Blastocele, entrando vetrificazione con un Blastocele fluido-riempita. La blastocisti artificialmente compressa rimane nella sua fase rattrappito attraverso la fase di equilibrazione intero. Durante la fase di vetrificazione, anche non cambia il suo volume. Poiché la morfometria di blastocisti Mostra un volume costante delle blastocisti artificialmente crollate durante il passo di previtrification, sembra che questa fase potrebbe essere più breve. Il protocollo descritto fornisce molti parametri aggiuntivi comparativi del comportamento di blastocisti durante e dopo la crioconservazione in base la velocità e l'intensità delle variazioni di volume, il numero di contrazioni Blastocele parziale o totali blastocisti crolla e il tempo di un Blastocele totale re-espansione o il tempo di schiusa.
Introduction
Crioconservazione degli embrioni preimpianto dall'in vitro programma di fertilizzazione (IVF) è al giorno d'oggi una pratica di routine nella maggior parte dei laboratori IVF. L'embrione lento congelamento Metodo cominciò ad essere usato clinicamente nel 1985, con l'introduzione di specifiche crioprotettori e congelatori controllati dal computer, che ha permesso il raffreddamento controllato degli embrioni fino a-7 ° C, quando la nucleazione di ghiaccio (semina) è stata indotta nella circostanti Crioprotettivi medium1. Di raffreddamento continuo, si svilupperebbe i cristalli di ghiaccio, causando l'iperosmolarità della frazione liquida restante e, di conseguenza, la disidratazione e restringimento delle cellule embrionali. A-30 ° C o da-80 ° C, gli embrioni sarebbero immersi nell'azoto liquido per conservarli più a lungo. Quello che stava accadendo con gli embrioni o ovociti durante il raffreddamento potrebbe essere osservato solo da cryomicroscopes appositamente adattato, che ha contribuito a migliorare la crioconservazione protocolli2. Il congelamento di blastocisti, un volume più alto- e più fluido contenuto fase embrionale, ha dato risultati clinici meno promettenti in quei giorni3.
La svolta nella crioconservazione della blastocisti è stata l'introduzione del metodo di vitrificazione, in cui la disidratazione delle cellule ha avvenuto prima di raffreddamento utilizzando alte concentrazioni di crioprotettori4. La rimozione del fluido da Blastocele prima vetrificazione può essere ottenuta anche facendo un'apertura meccanico tra due delle cellule trofoblastiche cellule5. Anche se il tasso di sopravvivenza immediata blastocisti dopo vitrificazione e il riscaldamento è superiore a 90% e il seguente risultato clinico il trasferimento di blastocisti vetrificate/riscaldato nella cavità uterina è quasi paragonabile ai risultati dopo il trasferimento di fresco embrioni, questo metodo di crioconservazione non è stato ancora standardizzato6,7. Protocolli di vitrificazione variano secondo (a) il tipo e la concentrazione di crioprotettori, (b) il numero di passi previtrification, (c) la durata delle singole fasi, (d) l'uso di un Blastocele artificiale compressione prima di vetrificazione o non, (e). crollando metodi, fase (f) l'espansione di blastocisti e (g) la temperatura di equilibrio/vetrificazione in cui gli embrioni dovrebbero essere vetrificato8. Poiché crioprotettori possono essere tossici per le cellule, il tempo di esposizione di blastocisti per queste soluzioni deve essere ben definito. Tuttavia, alcuni produttori di supporti di crioconservazione consentono protocolli molto flessibile.
L'interesse degli scienziati è solitamente concentrata sullo studio la possibilità di re-espansione di blastocisti con lo scopo di trovare nuovi biomarcatori con una migliore previsione di impianto6,9,10. Come blastocisti umane disidratano alle diverse fasi dell'aggiunta di crioprotettori prima vetrificazione e cosa succede con blastocisti dopo vitrificazione e il riscaldamento, quando crioprotettori devono essere rimosso da cellule, e come le blastocisti reidratare e ri-espandere dopo il riscaldamento, è non ben descritto né capito. Lo sviluppo di una metodologia per l'obiettivo e quantificati monitoraggio del comportamento di blastocisti durante le fasi differenti di crioconservazione è, così, razionale.
Con Time-lapse microscopi di diversi produttori, è ora possibile monitorare il comportamento della blastocisti in pre- e post-vetrificazione fasi. Includendo ulteriori computer strumenti, misure delle loro dimensioni (morfometria) anche possono essere eseguite. Per misurare la diminuzione o aumento delle dimensioni dell'embrione in un dato momento, è possibile oggettivare la valutazione della morfodinamica degli embrioni durante la disidratazione e reidratazione.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di etica medica nazionale il 19 aprile 2016 (n. 0120 – 204/2016 – 2).
1. messa a punto del sistema di registrazione di microscopio
- Spegnere la piastra riscaldante del microscopio.
- Prima di qualsiasi trattamento, scattare un'istantanea di una blastocisti sotto un microscopio invertito dotato di telecamera. Ricordarsi di notare l'ingrandimento a cui è stata registrata la blastocisti.
2. selezione e Pratoparation di blastocisti per la vitrificazione
- Selezionare soli completamente espansi blastocisti giorno-5 o 6 ° giorno per la crioconservazione con almeno un paio di interno cellule tumorali (ICM) massa e coesiva delle cellule trofoblastiche.
- Per blastocisti laser-trattati con un Blastocele crollato, soggetto una blastocisti di un impulso laser breve (0,4 - 0,7 ms) con un diametro del foro che variano da 4.3 a 9.4 µm, diretto tangenzialmente alla zona pellucida e ad un incrocio di due celle adiacenti trophectodermal. Consentire la blastocisti completamente o parzialmente crollare per 5 min.
- Per blastocisti non trattate con un Blastocele intatto, è necessario eseguire nessun trattamento particolare prima della vetrificazione.
Nota: Queste blastocisti sono considerati intatti.
3. preparazione del crioprotettore e una capsula di Petri per la fase di equilibratura
- Pipetta di pithe uso per decoronizzazione (diametro 135 µm) riempire asetticamente media di equilibrazione (mezzo di tampone HEPES M-199 con 7,5% DMSO, 7,5% glicole etilenico, 20% DSS) nei fori della zona microdroplet di una capsula di Petri 9-Pozzo appositamente progettato per Time-lapse microscopia e registrazione.
Nota: Decoronizzazione è un processo di rimozione di cellule del cumulo che circonda l'ovocita. L'uso di una pipetta per decoronizzazione contribuirà ad per evitare la creazione di bolle d'aria. - Sovrapposizione della zona di microdroplet con 30 µ l di media di equilibrazione.
4. trasferimento di blastocisti nella soluzione di equilibrazione
- Immergere una blastocisti laser-trattati o intatta nel mezzo di equilibrazione alla parte inferiore della zona microdroplet del piatto microdroplet per 10 min a temperatura ambiente (fase di equilibratura).
- Avviare un conto alla rovescia di 10 min, non appena la blastocisti viene trasferita al medium di equilibrazione.
5. registrazione della blastocisti nella fase di equilibratura
- Trasferire il piatto di microdroplet con la blastocisti ad un microscopio dotato di telecamera. Utilizzare lo stesso ingrandimento come precedentemente per scattare un'istantanea della blastocisti stessa. Posizione il microdroplet piatto affinché la blastocisti è posizionata approssimativamente nel centro della registrazione.
- Avviare la registrazione con il microscopio software di registrazione. Nota il tempo di conto alla rovescia durante il quale è avviata la registrazione.
Nota: Vedere risultati rappresentativi delle registrazioni di un intatto (Figura 1, Video 1) e una blastocisti compressa (Figura 2, Video 2) durante l'esposizione di 10 min per una soluzione di equilibrazione.
6. vetrificazione della blastocisti
- Asetticamente versare una goccia di 50-µ l della soluzione di vitrificazione (tamponata HEPES medio M-199 con 15% DMSO, glicole etilenico 15%, 20% DSS, saccarosio 0.5 M) in una capsula Petri 2 min prima della fine del conto alla rovescia.
- Interrompere la registrazione quando il conto alla rovescia 10 min finisce e trasferire rapidamente la blastocisti alla soluzione di vitrificazione per 30 s a temperatura ambiente.
- Pipettare delicatamente la blastocisti almeno 1 volta all'interno della soluzione di vitrificazione.
- Usare una cannuccia di vetrificazione per caricare la blastocisti. Caricare, sigillare e immergersi la vitrificazione paglia in azoto liquido (LN) entro 80 s, non superiore a 110 s dopo l'esposizione iniziale alla soluzione di vitrificazione.
7. video Editing della blastocisti registrata durante la fase di equilibratura
- Importare file video registrati nel software di editing video.
- In questa fase, spostare il cursore della timeline per 20 s. nota il numero di telaio.
Nota: Questo numero verrà utilizzato per decimare inutili fotogrammi video. Solo fotogrammi ogni 20 s verrà utilizzato. - Fare clic sulla scheda Video , quindi Frame rate.... Nella conversione del Frame rate, verificare che il campo di decimare da e immettere il numero di telaio indicato in precedenza. Confermare facendo clic su OK. Fare clic su File → Esporta → sequenza di immagini.
- Scegliete JPEG come formato di output, impostare la directory per contenere la sequenza di immagini salvata e fare clic su OK.
Nota: Questo creerà una directory con fino a 30 immagini della blastocisti registrata in sequenza durante la fase di equilibrazione di vetrificazione.
8. misure di Area della sezione trasversale di blastocisti da immagini create durante la fase di equilibratura
- Aprire il software di analisi video. Fare clic sulla scheda finestra e selezionare la sequenza temporale.
- Nel pannello Timeline, fare clic sul segno di striscia di pellicola e scegliere Aggiungi file multimediali... per aggiungere un'immagine della blastocisti prima della fase di equilibrazione di vetrificazione — e prima dell'intervento di laser, se c'era.
Nota: Questa immagine mostra la blastocisti al suo stato più esteso e l'area della sezione trasversale servirà come riferimento. - Aggiungere la sequenza di immagini della blastocisti corrispondente generata in precedenza con software di editing video (della fase di equilibrazione di vetrificazione).
- Vai a immagine → analisi → Seleziona coordinate → personalizzato per aprire la finestra di selezionare i punti dati .
- Deselezionare tutti i punti dati, quindi selezionare solo l' Area e confermare facendo clic su OK.
- Spostare il cursore della timeline nella finestra Timeline alla prima immagine.
- Fare clic sulla scheda finestra e scegli strumenti.
Nota: Questo attiverà il pannello strumenti sul lato sinistro. - Scegliete lo strumento selezione rapida.
- Posizionare il marcatore di strumento all'interno della blastocisti a toccare il bordo della blastocisti. Delineare la blastocisti inserendo il marcatore di strumento sul bordo esterno di blastocisti, facendo clic e tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse e trascinando il marcatore di strumento lungo il bordo esterno di blastocisti fino a sezione trasversale di blastocisti intero è selezionata.
Nota: la Zona pellucida non è una parte della misurazione, quindi deve essere escluso (Figura 5). - Nella finestra Timeline, fare clic sul Registro misurazioni e premere il pulsante Record misurazioni .
Nota: Questo registrerà l'area selezionata. - Tornare alla Timeline, fare clic destro sull'immagine e scegliere deseleziona.
- Spostare il cursore della timeline alla prossima immagine e fai clic sul riquadro corrispondente sotto di esso.
- Delineare la blastocisti nella nuova immagine con lo strumento selezione rapida. Ripetere la misurazione.
- Ripetere questa procedura (procedura 8,9-8.13) immagine sezioni trasversali di tutte le immagini sono misurati e registrati.
- Alla fine, andare nel Registro misurazioni, selezionare tutte le misurazioni sotto l'Area variabile ed esportarli in un file txt.
Nota: Le unità della sezione trasversale sono pixel quadrati.
9. modifica del File di dati con sezioni trasversali di blastocisti registrato da immagini create durante la fase di equilibratura
- Trasferire i dati di sezioni trasversali di blastocisti registrato dal file. txt in un editor di fogli di calcolo.
- Utilizzare il prima area della sezione trasversale valore come valore di riferimento 1 ed espresso (trasformazione) valore di riferimento di tutti gli altri valori ad essere una frazione di quello.
- Creare un nuovo Area_r variabile e incollare i valori di zona di transcodifica (tranne il valore di riferimento) sotto esso.
- Accanto alla variabile Area_r, creare una variabile di tempo e aggiungere il primo valore di tempo.
Nota: Il primo valore rappresenta il tempo che passate dal momento in cui che la blastocisti è stato esposto a soluzione di equilibrazione all'insorgenza di registrazione sotto un microscopio dotato di telecamera. - Calcolare le prossima volta consecutiva aggiungendo 20 s per il precedente valore di tempo.
Nota: Questo è l'intervallo di tempo utilizzato presso decimando inutili fotogrammi video creati durante la registrazione.
10. riscaldamento della blastocisti
- Preparare i supporti per il riscaldamento.
- Un giorno prima del riscaldamento della blastocisti, dispensare in asepsi tre gocce di 150-µ l del mezzo di recupero in un piatto di 4 pozzetti. Inoltre, asetticamente dispensare medio di recupero in un piatto di 9-Pozzo microdroplet appositamente progettati per microscopia time-lapse e registrazione. Coprire il mezzo di recupero con olio di paraffina e preincubate esso a 37 ° C con 6% CO2 e 5% O2.
Nota: Supporto di recupero è un medium di coltivazione per embrioni in fase blastocisti con aggiunta albumina sierica umana (HSA). L'HSA nel mezzo di recupero dovrebbe essere di 12 mg/mL. Per riempire i buchi nel piatto 9-Pozzo, utilizzare una pipetta per decumulazione degli ovociti per evitare la creazione di bolle d'aria, quindi sovrapporre la zona microdroplet con 30 µ l di terreno di recupero. - Il giorno del riscaldamento la blastocisti, asetticamente Dispensare 500 µ l di soluzione (TS) in un singolo pozzo di un piatto di 4 pozzetti di scioglimento e permettere che si riscaldi a 37 ° C in un incubatore senza CO2.
- A temperatura ambiente, in modo asettico dispensare una goccia di 50-µ l di soluzione di diluizione (DS) e due gocce di 50-µ l di soluzione (WS) di lavaggio in una capsula di Petri sterile. Coprire le gocce DS e WS1 e WS2 con olio di paraffina.
Nota: Invece di una capsula di Petri, un piatto di 4 pozzetti inoltre può essere utilizzato.
- Un giorno prima del riscaldamento della blastocisti, dispensare in asepsi tre gocce di 150-µ l del mezzo di recupero in un piatto di 4 pozzetti. Inoltre, asetticamente dispensare medio di recupero in un piatto di 9-Pozzo microdroplet appositamente progettati per microscopia time-lapse e registrazione. Coprire il mezzo di recupero con olio di paraffina e preincubate esso a 37 ° C con 6% CO2 e 5% O2.
- Scaldare la blastocisti.
- Identificare la paglia HSV con la blastocisti vetrificata per essere rimosso dal deposito di LN e trasferire rapidamente la paglia ad un serbatoio portatile LN-riempita in preparazione per la procedura di riscaldamento.
- Sollevare la paglia con il forcipe, appena sufficiente per esporre l'asta di movimentazione colorate. Utilizzare una spellafili autoregolabile per tagliare la paglia all'altezza dell'asta movimentazione colorate.
- Afferrare l'asta di movimentazione ed estrarlo dalla paglia con un movimento rapido, ma controllato, e immergersi immediatamente la spatola curva dell'asta movimentazione i 37 ° C TS.
- Agitare delicatamente l'asta di movimentazione per staccare la blastocisti e lasciarlo per un totale di 1 min in TS.
- A temperatura ambiente, trasferire le blastocisti consecutivamente a DS, WS1 e WS2 per 4 min in ogni mezzo.
- Dopo la procedura di riscaldamento, trasferimento di blastocisti per un piatto di 4 pozzetti con il mezzo di recupero e lavarlo in tutte le tre gocce pipettando delicatamente.
Nota: Il lavaggio è effettuato in circa 1 min. - Trasferire le blastocisti al time-lapse piatto 9-Pozzo con il mezzo di recupero. Mettere il piatto 9-bene sotto un time-lapse fotocamera in un'incubatrice (a 37 ° C con 6% CO2 e 5% O2).
Nota: Procedura scaldavivande Thre, che continua con l'immissione del 9-pozzetto sotto un time-lapse fotocamera in un'incubatrice, dura circa 17 min.
11. lapse della blastocisti Re-espansione durante il recupero post-riscaldamento
- Eseguire il software di registrazione time-lapse.
- Scegliere una macchina fotografica di registrazione.
- Premere il pulsante modalità Live .
- Posizionare il cursore del mouse sull'immagine e utilizzare il pulsante di scorrimento per ingrandire. Fare clic e tenere premuto il pulsante sinistro del mouse e spostare il cursore per posizionare il pozzo con la blastocisti al centro dello schermo.
- Sotto messa a fuoco, utilizzare le frecce verdi su-giù per concentrarsi l'aereo di registrazione della blastocisti. Sotto dell'intensità luminosa, impostare l'intensità della luce.
- Fare clic sul pulsante parametri microscopio per impostare il tempo di esposizione e Gamma.
- Premere Chiudi la modalità "live".
- Premere il pulsante di avvio progetto e immettere i dati di progetto, selezionare il tipo di piatto di cultura (3x3 o 4x4) e deselezionare tutte le posizioni tranne quello da registrare.
- Impostare i tempi di acquisizione per scattare una foto ogni 5 min.
- Avviare la registrazione premendo il pulsante approva . Registrare almeno 150 min.
- Interrompere la registrazione premendo il tasto Stop del progetto .
Nota: Vedere i risultati rappresentativi della registrazione di un intatto (Figura 3) e una blastocisti compressa (Figura 4) durante il periodo di recupero post-riscaldamento.
12. video Editing della blastocisti registrata durante il Re-espansione post-riscaldamento
- Andare alla cartella del progetto e individuare le immagini registrate sono circa 80 KB in dimensioni.
- Creare un'altra cartella e trasferire le immagini in esso. Rinominare le immagini in numeri in base al momento della creazione. Importare il video editing software come una sequenza di immagini.
- Vai alla scheda Video → filtro → Aggiungi e selezionare filtro trasforma Null .
- Fare clic sul pulsante di ritaglio sul lato destro e ritagliare l'immagine, lasciando visibile solo il campo con la blastocisti registrata. Confermare con OK e ancora OK.
- Fare clic su File → Esporta → sequenza di immagini. Scegliete JPEG come formato di output, impostare la directory per contenere la sequenza di immagini salvata e fare clic su OK.
Nota: Questo creerà immagini ridimensionate (tagliate), preparate per ulteriori misurazioni del software di analisi video.
13. impostazione di una scala di misurazione nel Software di analisi Video per le immagini create con il Software di registrazione time-lapse
- Eseguire l'analizzatore del software registrazione time-lapse.
- Aprire il progetto con la blastocisti registrata.
- Fare clic sul pulsante Analyze sul campo con la blastocisti registrato.
Nota: Si aprirà una nuova finestra Analyze. Fare clic sul pulsante di misurazione per visualizzare lo strumento di misura. - Utilizzare lo strumento di misurazione per misurare la larghezza dell'immagine intera.
- Pulsante destro del mouse sull'immagine e salvarlo. Nella finestra Proprietà, controllare la larghezza dell'immagine in pixel.
- Dividere la larghezza dell'immagine reale con la sua larghezza in pixel.
Nota: Questo calcola la lunghezza effettiva di un singolo pixel in questa immagine. - Eseguire il software di analisi video.
- Fare clic sulla scheda finestra e selezionare la sequenza temporale.
- Nel pannello Timeline, fare clic sul segno di striscia di pellicola e scegliere Aggiungi file multimediali... per aggiungere la sequenza di immagini della blastocisti ri-espansione post-calda.
- Fare clic su immagine → analisi → → Imposta scala di misurazione personalizzato per aprire la finestra di scala di misurazione. Per lunghezza in Pixel, immettere 1; per lunghezza logica, immettere la lunghezza effettiva calcolata in precedenza di un pixel (passo 13,6); per unità logiche, immettere µm. Salva il preset.
14. misure di Area della sezione trasversale di blastocisti da immagini create durante il Re-espansione post-riscaldamento
- Una volta che la scala di misurazione è impostato e la sequenza di immagini importate, misurare aree trasversali di blastocisti allo stesso modo come descritto nel passaggio 8, con l'unica differenza è che le aree di sezione trasversale misurate in queste misurazioni hanno unità in µm2 .
15. modifica del File di dati con sezioni trasversali di blastocisti registrate dalle immagini creato durante il Re-espansione post-riscaldamento
- Trasferire i dati di sezioni trasversali di blastocisti registrato dal file. txt in un editor di fogli di calcolo.
- Creare una variabile di tempo accanto alla variabile di zona e aggiungere il primo valore di tempo.
Nota: In questo caso, il primo valore di ora è impostato su 0 minuti, che è l'inizio della registrazione time-lapse. Ogni valore successivo volta consecutiva viene calcolata aggiungendo 5 minuti per il precedente valore di tempo. Cinque minuti è l'intervallo di tempo utilizzato tra due registrazioni di time-lapse consecutive.
16. creazione di un diagramma di linea
- Importare il file di dati del foglio di calcolo nel software di analisi statistica per la creazione di un grafico di tempo dei cambiamenti di sezione trasversale di blastocisti in tempo durante la fase di equilibrazione della vetrificazione o re-espansione post-riscaldamento.
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Representative Results
In una dimostrazione, abbiamo mostrato morfodinamica di blastocisti in un solo previtrification e una fase di post-riscaldamento. Una differenza di volume di blastocisti alla fine della fase di equilibrazione e all'inizio del recupero in terreno di coltura ha mostrato l'intensità della contrazione dell'embrione, che è, infatti, l'intensità di conservazione degli embrioni contro cristallizzazione di ghiaccio.
Come si può notare dalla Figura 1 e Video 1, la blastocisti intatta non crollo completamente in soluzione di equilibrazione. Il Blastocele contratta solo parzialmente, ma entro 10 minuti, lentamente ha raggiunto la dimensione di re-espansione del 70%. Al contrario, la blastocisti artificialmente crollata completamente svuotato il Blastocele immediatamente dopo il trattamento laser, ma in soluzione di equilibrazione, il suo volume non ha modificato qualsiasi altro (Figura 2, Video 2). La presentazione del Blastocele re-espansione nel mezzo di recupero (Figura 3 e Figura 4) con microfotografie e con linea diagramma mostra diversi modelli di crescita Blastocele. Un display di una singola misura della sezione trasversale della blastocisti è illustrato nella Figura 5.
Nel mezzo di vetrificazione con una maggiore concentrazione di crioprotettori, intatti blastocisti intensivamente ristretto ancora una volta, mentre il volume compresso di blastocisti è rimasto quasi invariato. Da una presentazione grafica, utilizzando il protocollo presentato qui, è evidente che la blastocisti intatta subisce una riduzione graduale del Blastocele (Figura 6), una volta alla soluzione di equilibrazione e una volta nel mezzo di vetrificazione, mentre il crollato blastocisti ha raggiunto una fase rattrappita all'inizio dell'intervento con il laser (Figura 7). Questo pone la questione se 10 minuti della fase di equilibrazione è veramente necessario per blastocisti compressi, o se questo periodo può essere abbreviato.
La presentazione del Blastocele re-espansione può essere lineare o interrotto con parecchi più grandi o più piccole contrazioni (Figura 8).
Figura 1: Time-lapse microfotografia dei cambiamenti di un blastocisti intatto durante l'esposizione alla soluzione di equilibrazione. Singole immagini sono state registrate ogni 20 secondi. La barra della scala è 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Time-lapse microfotografia dei cambiamenti di un blastocisti artificialmente crollato durante l'esposizione alla soluzione di equilibrazione. Singole immagini sono state registrate ogni 20 secondi. La barra della scala è 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Time-lapse microfotografia dei cambiamenti di un blastocisti intatto durante il riscaldamento recoverypost. Singole immagini sono state registrate ogni 5 minuti. La barra della scala è 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Time-lapse microfotografia dei cambiamenti di una blastocisti crollato durante il riscaldamento recoverypost. Singole immagini sono state registrate ogni 5 minuti. La barra della scala è 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: visualizzazione di una singola misura della sezione trasversale di una blastocisti. La blastocisti è piena con attenzione con lo strumento selezione appropriata nel software di analisi video. La zona pellucida è sempre esclusa dalla misurazione. La barra della scala è 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: rappresentazione delle modifiche nella sezione trasversale di una blastocisti intatto. Questi pannelli mostrano la rappresentazione dei cambiamenti nell'area della sezione trasversale di un blastocisti intatto durante l'esposizione alla soluzione di equilibrazione (A) alla vetrificazione e (B) durante il recupero post-riscaldamento. Le unità della sezione trasversale sono relativi a sezione trasversale di blastocisti iniziale prima di vetrificazione. La linea tratteggiata che collega pannelli A e B è immaginaria, che rappresentano le modifiche durante la vetrificazione, raffreddamento a-196 ° C e il riscaldamento a 37 ° C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: rappresentazione delle modifiche nella sezione trasversale di una blastocisti compressa. Questi pannelli mostrano la rappresentazione delle modifiche nell'area della sezione trasversale di (A) una blastocisti crollata durante l'esposizione alla soluzione di equilibrazione (B) alla vetrificazione e (C) durante il recupero post-riscaldamento. Le unità della sezione trasversale sono relativo all'area della sezione trasversale di blastocisti iniziale prima di crollare e vetrificazione. La linea tratteggiata al pannello A è immaginaria e rappresenta il punto iniziale e finale durante il crollo di blastocisti. Anche la linea tratteggiata immaginaria tra pannelli B e C, rappresenta le modifiche durante la vetrificazione, raffreddamento a-196 ° C e il riscaldamento a 37 ° C. Solo le linee continue in pannelli B e C sono il risultato di misurazioni effettive della sezione trasversale durante il processo di recupero e di equilibrazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: rappresentazione grafica dei diversi modelli di recupero di blastocisti dopo il riscaldamento. La barra della scala è 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: video time-lapse dei cambiamenti di un blastocisti intatto durante l'esposizione alla soluzione di equilibrazione. Il video rappresenta i cambiamenti, che durano quasi 10 minuti in tempo reale. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Video 2: video time-lapse dei cambiamenti di una blastocisti crollato durante l'esposizione alla soluzione di equilibrazione. Il video rappresenta i cambiamenti, che durano quasi 10 minuti in tempo reale. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
Il protocollo per l'osservazione di blastocisti morfodinamica durante e dopo la crioconservazione può essere effettuata anche utilizzando strumenti simili e strumenti software di altri produttori. Time-lapse sistemi regolati per embriologia permettono il monitoraggio continuo dello sviluppo embrionale. Lo scopo di questo lavoro era di introdurre la quantificazione del comportamento di blastocisti durante la preparazione di blastocisti per la vitrificazione e dopo il loro riscaldamento. Questo è stato fatto la misurazione oggettiva dei cambiamenti nella morfologia su una scala cronologica. Ottenuti risultati di queste misurazioni possono essere matematicamente analizzati e confrontati con altri risultati. Tra i parametri che possono essere seguiti dal protocollo descritto sono cambiamenti nelle dimensioni della blastocisti, sua intima massa del somatocita, il Blastocele, o la zona pellucida entro un certo periodo di tempo. Le dimensioni possono essere visualizzate come l'area della superficie nella più grande sezione trasversale di blastocisti, la blastocisti circonferenza o il diametro e, dopo il calcolo, anche come il suo volume.
Negli studi precedenti, utilizzando sistemi di time-lapse, misure di velocità di espansione Blastocele sono state fatte solo su embrioni freschi11. In blastocisti vetrificate/riscaldato, solo le dimensioni dei blastocisti sono state misurate subito dopo il riscaldamento e prima del trasferimento dell'embrione, o il periodo di tempo è stato analizzato in cui riscaldato blastocisti espanse nuovamente alla zona pellucida9,10 . Più dettagliate blastocisti re-espansione dinamica sono stati analizzati solo nel nostro precedente studio8. In questo studio, il protocollo morfometrica è già stato utilizzato per rilevare la velocità e modello di re-espansioni di blastocisti dopo il riscaldamento. Anche se questi biomarcatori di crescita di blastocisti hanno dimostrato di non per avere un alto valore predittivo per l'impianto, può essere utilizzati per il confronto del potenziale di recupero di blastocisti dopo vitrificazione e riscaldamento con protocolli e crioconservazione diversi media . Le contrazioni maggiore della blastocisti durante Blastocele re-espansione suggeriscono la debolezza dello strato trophectodermal che poteva essere causato durante la crioconservazione e nella sua incapacità di sopportare la pressione fatta dal Blastocele fluido-riempita.
Il protocollo descritto morfometriche può fornire molti ulteriori analisi comparative di comportamento di blastocisti, non solo dopo crioconservazione, misurando la velocità e l'intensità dei cambiamenti nel volume, il numero di contrazioni Blastocele parziale o totale blastocisti crolla, il tempo di re-espansione totale Blastocele, o il tempo di schiusa. Inoltre, può essere utilizzato anche durante le fasi di previtrification per determinare la tempistica ottima di esposizione di blastocisti a diverse concentrazioni di crioprotettori, come è stato presentato nei risultati. Vanderzwalmen et al ha mostrato su ovociti di topi che la vetrificazione può anche essere successo se la pressione osmotica intracellulare non raggiunge un equilibrio con la soluzione di crioprotettore esterna12. La fase solo problematica per la registrazione di blastocisti durante la conservazione è il periodo in soluzione di vetrificazione a causa del tempo limitato; l'embrione deve essere esposto a una maggiore concentrazione di crioprotettori e imballato in paglia in meno di 90 secondi. Per queste misurazioni, esso sarebbe consigliabile utilizzare solo le blastocisti che vengono donate per la ricerca. Tuttavia, clinicamente disponibile blastocisti possono essere registrato e misurato nuovamente subito dopo il riscaldamento, con l'obiettivo di osservare come si comportano in diluizione e soluzioni di lavaggio. Immediatamente dopo un trasferimento di blastocisti dalla soluzione di lavaggio per il mezzo di recupero, blastocisti tendono a galleggiare sul fondale. Questo può rappresentare una difficoltà nel mantenere l'embrione sullo stesso piano focale durante la registrazione. Per risolvere questo problema, si consiglia di preparare un piatto con gocce appiattite del mezzo. Un problema simile è stato osservato da Vanderzwalmen et al. 12.
In ulteriore ricerca, sarebbe utile esplorare se la lunghezza dell'esposizione della blastocisti artificialmente compressi ai crioprotettori potrebbe essere ridotto, di conseguenza riducendo al minimo l'effetto tossico di queste sostanze chimiche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è una parte del progetto di ricerca programma P3-0327 e ricerca J3-7177, fondato dalla Fondazione di ricerca sloveno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
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