用于玻璃化和变暖步骤中囊胚行为客观评估的形态学协议
Summary
在这里, 我们提出了一个延时形态测量方案, 以跟踪在预防干预和升温后恢复过程中囊胚收缩和再膨胀的强度。该方案可在配备延时显微镜的体外受精实验室中应用, 并建议在开发最佳囊胚玻璃化方法时使用。
Abstract
本文介绍了基于延时显微摄影的非侵入性囊胚形态测量方法, 以准确监测玻璃化前后各个阶段囊胚体积的变化。该方法可用于通过观察玻璃化前后不同阶段的囊胚收缩和再膨胀, 寻找最佳的囊胚接触不同浓度的低温保护剂的最佳时机。利用该方法, 可以优化囊胚玻璃化方案。为了更好地证明这种形态测量方法的有效性, 比较了两种不同的玻璃化囊胚制备方案;一个使用人工囊胚崩溃和一个没有这种干预前玻璃化。两个囊胚的体积变化之后是延时微摄影, 并通过照片编辑软件工具进行测量。测量每20秒在预防阶段进行一次, 在变暖后每5分钟进行一次。每个时间单位的囊胚尺寸的变化在线形图中以图形方式呈现。结果表明, 在一个漫长的平衡脱效阶段, 完整的囊胚先收缩, 然后慢慢地补充囊胚, 进入玻璃化与充满液体的囊胚。人工塌陷的囊胚在整个平衡阶段保持在其萎缩阶段。在玻璃化阶段, 它也不会改变其体积。由于囊胚形态测量显示在预防步骤中人为塌陷的囊胚的恒定体积, 看来这个阶段可能会更短。该协议根据体积变化的速度和强度、部分囊胚收缩次数或全囊胚, 提供了冷冻保存期间和之后囊胚行为的许多附加比较参数塌陷, 和时间到一个总的囊胚重新膨胀或时间孵化。
Introduction
从体外受精计划 (ivf) 中对人类植入前胚胎进行冷冻保存是当今大多数试管授精实验室的常规做法。缓慢胚胎冷冻方法于1985年开始临床使用, 引入了特定的低温保护剂和计算机控制的冰柜, 使胚胎的冷却控制低至-7°c, 当冰核 (播种) 诱导在周围的低温保护介质1。通过连续冷却, 冰晶会生长, 导致剩余液体部分的高渗透性, 从而导致胚胎细胞的脱水和收缩。在-30°c 或-80°c 时, 胚胎会进入液氮进行更长的储存。只有经过特殊调整的冷冻显微镜才能观察到冷却过程中胚胎或卵母细胞发生的情况, 这有助于改进冷冻保存方案2。冷冻囊胚, 一个较高的体积和更多的含液的胚胎阶段, 在这几天的临床结果不太乐观3。
囊胚冷冻保存的突破是引入了玻璃化方法, 即利用高浓度的低温保护剂在冷却前对细胞进行脱水。在玻璃化之前, 也可以通过在两个营养体细胞5之间进行机械开口来去除囊胚细胞中的液体。玻璃化和变暖后的直接囊胚存活率在90% 以上, 而玻璃化/加热囊胚进入子宫腔后的临床结果几乎与新鲜移植后的结果相当胚胎, 这种冷冻保存方法还没有标准化6,7。玻璃化协议因 (a) 低温保护剂的类型和浓度、(b) 预防步骤的数量、(c) 个别步骤的持续时间、(d) 在玻璃化或不玻璃化之前使用人工囊胚而有所不同, (e)塌陷方法, (f) 囊胚扩张阶段, (g) 平衡玻璃化温度, 胚胎应在该温度下进行玻璃化 8.由于低温保护剂对细胞可能有毒, 因此必须很好地确定囊胚接触这些溶液的时间。但是, 一些冷冻保存介质制造商允许非常灵活的协议。
科学家们的兴趣通常集中在研究囊胚再膨胀能力上, 目的是寻找新的生物标志物, 更好地预测植入 6、9、10.当冷冻保护剂必须从细胞中去除时, 人类囊胚如何在玻璃化前加入低温保护剂的不同步骤脱水, 以及玻璃化和升温后囊胚会发生什么, 以及囊胚如何补充水分和变暖后重新扩张, 没有很好的描述, 也没有很好的理解。因此, 制定一种方法, 对不同冷冻保存步骤中的囊胚行为进行客观和量化的监测, 是合理的。
随着不同制造商的延时显微镜, 现在可以监测玻璃化前后的囊胚的行为。通过包括额外的计算机工具, 也可以对其大小进行测量 (形态测量)。通过测量胚胎大小在给定时间的减少或增加, 可以将脱水和补液过程中胚胎形态动力学的评价客观化。
Protocol
Representative Results
Discussion
冷冻保存期间和保存后的囊胚形态观察方案也可以使用其他制造商的类似仪器和软件工具进行。根据胚胎学调整的延时系统允许对胚胎发育进行持续监测。本工作的目的是介绍在准备玻璃化过程中和在玻璃化后囊胚行为的定量。这是通过客观地测量时间刻度上的形态变化来实现的。获得的测量结果可以进行数学分析, 并与其他结果进行比较。在所述协议可以遵循的参数中, 有囊胚大小、内部细胞质…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是斯洛文尼亚研究基金会创建的研究项目 p3-0327 和 P3-0327 研究项目的一部分。
Materials
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
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