Morphometrische Protokoll für die objektive Beurteilung der Blastozyste Verhalten während der Verglasung und wärmenden Schritte
Summary
Hier präsentieren wir ein Time-Lapse morphometrische-Protokoll, um die Intensität der Blastozyste Schrumpfung und Re-Expansion während Previtrification Interventionen und Post-wärmende Erholung folgen. Die Anwendung des Protokolls ist möglich in in-vitro- Befruchtung Labors mit Zeitraffer Mikroskopen ausgestattet und wird bei der Entwicklung einer optimalen Blastozyste-Verglasung-Methode empfohlen.
Abstract
Dieser Artikel beschreibt die nicht-invasive Methode der Blastozyste Morphometrie basierend auf Time-Lapse Mikrofotografie für die präzise Überwachung von einer Blastozyste Lautstärke ändern während der einzelnen Phasen vor und nach der Verglasung. Die Methode kann bei der Suche nach den optimalen Zeitpunkt der Blastozyste Exposition gegenüber verschiedenen Konzentrationen von Kryoprotektanten durch die Beobachtung der Blastozyste Schrumpfung und Re-Expansion in verschiedenen Pre- und Post-Verglasung Phasen hilfreich sein. Mit dieser Methode kann die Blastozyste Verglasung Protokoll optimiert werden. Für eine bessere Demonstration von der Nützlichkeit dieser morphometrische Methode sind zwei verschiedene Blastozyste Vorbereitung Protokolle für die Verglasung im Vergleich; einmal mit einer künstlichen Blastocöl zusammenbricht und einmal ohne diese Intervention vor der Verglasung. Beide Blastozysten Volumenänderungen sind gefolgt von Time-Lapse Mikrofotografie und gemessen an Fotobearbeitungs-Software-Tools. Die Messungen sind alle 20 Sekunden in Previtrification Phasen und alle 5 Minuten in der Post-Erwärmung. Die Änderungen der Blastozyste Dimensionen pro Zeiteinheit sind in Zeile Diagrammen grafisch dargestellt. Die Ergebnisse zeigen eine lange Gleichgewichtherstellung Previtrification Phase in der intakte Blastozyste zuerst verkleinert und dann langsam füllt das Blastocöl Eingabe Verglasung mit einer Flüssigkeit gefüllten Blastocöl. Die künstlich reduzierte Blastozyste bleibt in seinen geschrumpften Phase durch die gesamte Gleichgewichtherstellung Phase. Während der Phase der Vitrifikation ändert es auch nicht sein Volumen. Da die Blastozyste Morphometrie ein konstantes Volumen künstlich reduzierten Blastozysten während der Previtrification-Schritt zeigt, scheint es, dass dieser Phase kürzer sein könnte. Das beschriebene Protokoll bietet viele zusätzliche Vergleichsparameter der Blastozyste Verhalten während und nach der Kryokonservierung auf der Grundlage der Geschwindigkeit und Intensität der die Volumenänderungen, die Anzahl der partiellen Blastocöl Kontraktionen oder total Blastozyste bricht zusammen, und die Zeit, um eine totale Blastocöl Re-Erweiterung oder die Zeit zu schlüpfen.
Introduction
Kryokonservierung von Embryonen Präimplantationsdiagnostik aus dem in-vitro- Befruchtung Programm (IVF) ist heutzutage eine Routinepraxis in die meisten IVF-Labors. Langsam Embryos Einfrieren Methode begann 1985 mit der Einführung von spezifischen Kryoprotektanten und computergesteuerte Gefriergeräten, die ermöglicht die kontrollierte Kühlung von Embryonen bis-7 ° C, bei Eisnukleation (Aussaat) im induziert wurde klinisch verwendet werden die umliegenden Cryoprotective mittlere1. Durch kontinuierliche Kühlung würde die Eiskristalle wachsen, verursachen die Hyperosmolality von der restlichen flüssigen Anteil und damit die Austrocknung und Schrumpfung der embryonalen Zellen. Bei-30 ° C oder-80 ° C würde die Embryonen in flüssigem Stickstoff bei längerer Lagerung gestürzt. Was geschah mit den Embryonen oder Eizellen beim Abkühlen konnte nur durch speziell angepasste Cryomicroscopes, die zur Verbesserung der Kryokonservierung Protokolle2beobachtet werden. Das Einfrieren von Blastozysten, ein höheres Volumen und mehr Flüssigkeit enthalten embryonalen Stadium gab weniger vielversprechende klinische Ergebnisse in diesen Tagen-3.
Der Durchbruch in der Kryokonservierung der Blastozyste war die Einführung der Vitrifikation Methode, in der die Dehydration der Zellen stattgefunden hat, vor der Kühlung mit hohen Konzentrationen von Kryoprotektanten4. Das Entfernen der Flüssigkeit von der Blastocöl vor der Verglasung kann auch erreicht werden, indem man eine mechanische Öffnung zwischen zwei Trophektoderm Zellen5. Obwohl die unmittelbare Blastozyste Überlebensrate nach Verglasung und Erwärmung oben 90 % und die klinische Outcome nach ist verglast/erwärmt Blastozyste in die Gebärmutterhöhle übertragen fast vergleichbar mit Ergebnisse nach der Übertragung der frisch Embryonen, diese Methode der Kryokonservierung wurde noch nicht standardisierten6,7. Vitrifikation Protokolle variieren je nach (a) die Art und Konzentration der Kryoprotektanten, (b) die Anzahl der previtrification Schritte, (c) die Dauer der einzelnen Schritte, (d) den Einsatz einer künstlichen Blastocöl kollabiert vor der Verglasung oder nicht, (e). zusammenbrechende Methoden, (f) die Blastozyste Erweiterung Bühne und (g) die Gleichgewichtherstellung/Verglasung-Temperatur auf die Embryonen werden sollte, verglaste8. Da Kryoprotektanten für Zellen giftig sein können, muss die Blastozyste Belichtungszeit zu diesen Lösungen genau definiert werden. Jedoch können einige Kryokonservierung Medien Hersteller sehr flexibel Protokolle.
Das Interesse der Wissenschaftler konzentriert sich in der Regel nach dem Studium der Blastozyste Re-Expansion-Fähigkeit mit dem Ziel, neue Biomarker mit einer besseren Vorhersage von Implantation6,9,10zu finden. Wie menschliche Blastozysten auf verschiedenen Stufen entwässern des Hinzufügens von Kryoprotektanten vor der Verglasung und was passiert mit Blastozysten nach Verglasung und Erwärmung, wenn Kryoprotektanten müssen entfernt werden, aus den Zellen, und wie die Blastozysten rehydrieren und Re-erweitern nach Erwärmung, ist nicht gut beschrieben noch verstanden. Die Entwicklung einer Methodik für das Ziel und quantifizierte Überwachung der Blastozyste Verhalten bei verschiedenen Kryokonservierung Schritte ist somit Begründung.
Mit Time-Lapse Mikroskope verschiedener Hersteller ist es nun möglich, das Verhalten der Blastozyste im Pre- und Post-Verglasung Phasen zu überwachen. Durch die Einbeziehung zusätzlicher Computer-Tools, können auch Messungen von ihrer Größe (Morphometrie) durchgeführt werden. Durch Messung der Abnahme oder Zunahme der Größe der Embryo zu einem bestimmten Zeitpunkt, es ist möglich, die Bewertung der Morphodynamics der Embryonen während der Austrocknung und Rehydrierung zu objektivieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll für die Beobachtung der Blastozyste Morphodynamics während und nach der Kryokonservierung auch mit ähnlichen Instrumenten und Software-Tools anderer Hersteller durchgeführt werden kann. Zeitraffer-bereinigt um Embryologie Systeme ermöglichen die kontinuierliche Überwachung der Entwicklung des Embryos. Das Ziel dieser Arbeit war die Quantifizierung der Blastozyste Verhalten während der Vorbereitung der Blastozysten für Verglasung und nach deren Erwärmung einzuführen. Dies geschah durch die objektiv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit ist ein Teil der Forschung Programm P3-0327 und Forschungsprojekt J3-7177, von der slowenischen Research Foundation gegründet.
Materials
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming – a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
