Morfométricos de protocolo para la evaluación objetiva del comportamiento del blastocisto durante la vitrificación y el calentamiento pasos
Summary
Aquí presentamos un protocolo de Time-lapse morfométricos para seguir la intensidad de la contracción de blastocisto y re-expansión durante intervenciones previtrification y la recuperación post calentamiento. La aplicación del protocolo en vitro fecundación laboratorios con microscopios de lapso de tiempo es posible y se recomienda en el desarrollo de un método de vitrificación de blastocistos óptima.
Abstract
Este artículo describe el método no invasivo de blastocisto Morfometría basada en time-lapse microfotografía para el control preciso del volumen de un blastocisto cambiando durante las fases individuales antes y después de la vitrificación. El método puede ser útil en la búsqueda del momento más óptimo de la exposición de blastocisto a distintas concentraciones de crioprotectores, observando la contracción de blastocisto y re-expansión en diferentes pre- y post vitrificación fases. Con esta metodología, se puede optimizar el protocolo de vitrificación de blastocistos. Para una mejor demostración de la utilidad de este método morfométrico, se comparan dos protocolos de preparación de diferentes blastocisto para vitrificación; uno con el uso de un artificial blastocoel colapso y otro sin esta intervención antes de vitrificación. Los cambios en el volumen de blastocistos son seguidos por microfotografía Time-lapse y medidas por herramientas de software de edición de fotos. Las mediciones se toman cada 20 segundos en las fases previtrification y cada 5 minutos en el período post calentamiento. Los cambios de las dimensiones del blastocisto por unidad de tiempo se presentan gráficamente en diagramas unifilares. Los resultados muestran una fase de previtrification de largo equilibrado en el que el blastocisto intacto primero se contrae y luego rellena lentamente el blastocoel, entrar en vitrificación con un blastocoel llena de líquido. El blastocisto artificial derrumbado permanece en su etapa contraído a través de la fase de equilibrar todo. Durante la fase de vitrificación, también no cambia su volumen. Puesto que la morfometría de blastocisto muestra un volumen constante de los blastocistos artificialmente colapsados durante el paso de previtrification, parece que esta etapa podría ser más corta. El protocolo descrito proporciona muchos parámetros adicionales comparativos de comportamiento del blastocisto durante y después de la criopreservación sobre la base de la velocidad y la intensidad de los cambios de volumen, el número de contracciones del blastocoel parcial o total de blastocistos se derrumba y el tiempo para una re-expansión del blastocoel total o el tiempo de incubación.
Introduction
Criopreservación de embriones preimplantación humanos en vitro fecundación del programa de (FIV) es actualmente una práctica habitual en la mayoría de los laboratorios FIV. El embrión lento congelación método comenzó a utilizarse clínicamente en 1985, con la introducción de crioprotectores específicos y congeladores controlados por computadora, que permitió el enfriamiento controlado de embriones hasta-7 ° C, cuando la nucleación de hielo (siembra) fue inducida en el alrededor de crioprotectores medio1. Por enfriamiento continuo, crecen los cristales de hielo, causando el hyperosmolality de la fracción líquida restante y, en consecuencia, la deshidratación y contracción de las células embrionarias. A-30 ° C o -80 ° C, los embriones se le hundió en el nitrógeno líquido para un almacenaje más largo. Sólo por cryomicroscopes especialmente adaptados, que ayudó a mejorar los protocolos de criopreservación2se pudo observar lo que sucedía con los embriones u ovocitos durante el enfriamiento. La congelación de blastocistos, un volumen más alto y más etapa embrionaria contiene líquido, dio los resultados clínicos menos prometedoras en aquellos días3.
Los avances en la criopreservación del blastocisto era la introducción del método de vitrificación, en el que la deshidratación de las células tuvo lugar antes de enfriamiento mediante el uso de altas concentraciones de crioprotectores4. La eliminación del fluido del blastocoel antes de vitrificación se logra también haciendo una apertura mecánica entre dos de las células trophectoderm5. Aunque la tasa de supervivencia inmediata blastocisto después de la vitrificación y el calentamiento es por encima de 90% y el siguiente resultado clínico la transferencia de blastocitos vitrificados/calentados en la cavidad uterina es casi comparable a los resultados después de la transferencia de frescos embriones, este método de criopreservación no ha sido aún estandarizada6,7. Protocolos de vitrificación varían según el tipo y la concentración de crioprotectores, (b) el número de pasos de previtrification, (c) la duración de cada paso, (d) el uso de un artificial blastocoel que se derrumban antes de vitrificación o no, (e). colapso de métodos, (f) la expansión del blastocisto etapa y (g) la temperatura de equilibrio/vitrificación en que los embriones deben ser vitrificados8. Desde crioprotectores pueden ser tóxicos para las células, el tiempo de exposición de blastocisto a estas soluciones tiene que ser definidas. Sin embargo, algunos fabricantes de medios de criopreservación que protocolos muy flexibles.
El interés de los científicos generalmente se centra en el estudio de la capacidad de re-expansión del blastocisto con el objetivo de buscar nuevos biomarcadores con un mejor pronóstico de implantación6,9,10. Cómo blastocistos humanos deshidratan en distintas etapas de la adición de crioprotectores antes de vitrificación y que pasa con blastocistos después de la vitrificación y el calentamiento, cuando crioprotectores han de ser eliminados de las células, y cómo los blastocistos rehidratar y volver a expandir después de calentamiento, no bien descrito ni entendido. El desarrollo de una metodología para el objetivo y cuantificado seguimiento de comportamiento del blastocisto durante los pasos de criopreservación diferentes es, pues, razón de ser.
Con microscopios de Time-lapse de diversos fabricantes, ahora es posible monitorear el comportamiento del blastocisto en pre y post vitrificación fases. Mediante la inclusión de herramientas informáticas adicionales, también se pueden realizar mediciones de su tamaño (morfometría). Medición de la disminución o aumento de tamaño del embrión en un momento dado, es posible objetivar la evaluación de la morfodinámica de embriones durante la deshidratación y rehidratación.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo para la observación de la morfodinámica del blastocisto durante y después de criopreservación puede también llevarse a cabo mediante el uso de instrumentos similares y herramientas de software de otros fabricantes. Sistemas Time-lapse para embriología permiten el monitoreo continuo del desarrollo embrionario. El propósito de este trabajo fue introducir la cuantificación del comportamiento del blastocisto durante la preparación de blastocistos para vitrificación y después de su calentamiento. Esto …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es una parte de investigación programa P3-0327 e investigación J3-7177, fundada por la Fundación de investigación de Eslovenia.
Materials
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
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