विरिफिकेशन और वार्मिंग के दौरान ब्लास्टोसिस्ट व्यवहार के उद्देश्य मूल्यांकन के लिए morphometric प्रोटोकॉल कदम
Summary
यहां हम एक समय चूक morphometric प्रोटोकॉल वर्तमान के लिए ब्लास्टोसिस्ट संकोची और पुनः विस्तार की तीव्रता का पालन करें previtrification हस्तक्षेप और पोस्ट वार्मिंग वसूली के दौरान । प्रोटोकॉल के आवेदन में संभव है इन विट्रो निषेचन प्रयोगशालाओं समय चूक सूक्ष्मदर्शी के साथ सुसज्जित है और एक इष्टतम ब्लास्टोसिस्ट विरिफिकेशन विधि के विकास में सिफारिश की है ।
Abstract
यह लेख एक ब्लास्टोसिस्ट की सटीक निगरानी के लिए समय-चूक microphotography के आधार पर ब्लास्टोसिस्ट आकारमिति के noninvasive विधि का वर्णन व्यक्तिगत चरणों से पहले और विरिफिकेशन के बाद बदलती मात्रा । इस विधि के सबसे इष्टतम समय के लिए खोज में उपयोगी हो सकता है ब्लास्टोसिस्ट जोखिम के विभिंन सांद्रता को cryoprotectants अवलोकन द्वारा ब्लास्टोसिस्ट सिकुड़न और फिर से विस्तार में अलग पूर्व और बाद के विरिफिकेशन चरणों । इस पद्धति के साथ, ब्लास्टोसिस्ट विरिफिकेशन प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जा सकता है । इस morphometric विधि की उपयोगिता का एक बेहतर प्रदर्शन के लिए, दो विभिन्न ब्लास्टोसिस्ट तैयारी प्रोटोकॉल के लिए तुलना कर रहे हैं; एक कृत्रिम blastocoel टूट का उपयोग कर के साथ एक और विरिफिकेशन से पहले इस हस्तक्षेप के बिना एक । दोनों blastocysts ‘ मात्रा में परिवर्तन समय चूक microphotography द्वारा पीछा कर रहे है और तस्वीर संपादन सॉफ्टवेयर उपकरण द्वारा मापा । मापन के लिए हर 20 सेकंड में ले रहे है previtrification चरणों और हर 5 मिनट के बाद वार्मिंग की अवधि में । समय इकाई के अनुसार ब्लास्टोसिस्ट आयामों के परिवर्तन रेखांकन रेखा आरेख में प्रस्तुत किए जाते हैं । परिणाम एक लंबे समय के साम्य previtrification चरण जिसमें अक्षुण्ण ब्लास्टोसिस्ट पहले सिकुड़ती है और फिर धीरे से ब्लास्टोसिस्ट फिर से भरना, एक तरल पदार्थ से भरे ब्लास्टोसिस्ट के साथ विरिफिकेशन में प्रवेश दिखा । कृत्रिम रूप से ढह ब्लास्टोसिस्ट पूरे समानता चरण के माध्यम से अपने सिकुड़ा हुआ चरण में रहता है । विरिफिकेशन चरण के दौरान, यह भी इसकी मात्रा में परिवर्तन नहीं करता है । के बाद से ब्लास्टोसिस्ट आकारमिति कृत्रिम रूप से ध्वस्त ब्लास्टोसिस्ट की एक निरंतर मात्रा previtrification कदम के दौरान पता चलता है, ऐसा लगता है कि इस चरण कम हो सकता है । वर्णित प्रोटोकॉल के दौरान और गति और मात्रा में परिवर्तन की तीव्रता के आधार पर cryopreservation के बाद ब्लास्टोसिस्ट व्यवहार के कई अतिरिक्त तुलनात्मक मापदंडों प्रदान करता है, आंशिक ब्लास्टोसिस्ट संकुचन या कुल ब्लास्टोसिस्ट की संख्या गिर, और एक कुल blastocoel पुनः विस्तार या समय के लिए समय के लिए अंडे ।
Introduction
इन विट्रो निषेचन कार्यक्रम (आईवीएफ) में से मानव preimplantation भ्रूण के cryopreservation आजकल ज्यादातर आईवीएफ प्रयोगशालाओं में एक नियमित अभ्यास है । धीमी भ्रूण ठंड विधि १९८५ में नैदानिक इस्तेमाल किया जा करने के लिए शुरू किया, विशिष्ट cryoprotectants और कंप्यूटर नियंत्रित फ्रीजर की शुरूआत के साथ, जो-7 डिग्री सेल्सियस के नीचे भ्रूण के नियंत्रित ठंडा सक्षम है, जब बर्फ के न्यूक्लिएशन (seeding) में प्रेरित किया गया था आसपास के cryoprotective मध्यम1. लगातार ठंडा करके, बर्फ क्रिस्टल विकसित होता है, शेष तरल अंश की hyperosmolality के कारण और, फलस्वरूप, निर्जलीकरण और भ्रूणीय कोशिकाओं के सिकुड़न । -30 डिग्री सेल्सियस या-८० डिग्री सेल्सियस, भ्रूण लंबे समय तक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में गिर जाएगा । कूलिंग के दौरान भ्रूण या अंडाणुओं के साथ क्या हो रहा था केवल विशेष रूप से अनुकूलित cryomicroscopes, जो cryopreservation प्रोटोकॉल2में सुधार करने में मदद के द्वारा मनाया जा सकता है । blastocysts की ठंड, एक उच्च मात्रा और अधिक तरल पदार्थ निहित भ्रूणीय चरण, उन दिनों में कम आशाजनक नैदानिक परिणाम दिया3.
ब्लास्टोसिस्ट के cryopreservation में सफलता विरिफिकेशन विधि की शुरूआत थी, जिसमें कोशिकाओं के निर्जलीकरण cryoprotectants4की उच्च सांद्रता का उपयोग करके ठंडा करने से पहले जगह ले ली । विरिफिकेशन से पहले ब्लास्टोकोएल से द्रव को हटाने को भी दो ट्रोफेक्टोडर्म कोशिकाओं के बीच एक यांत्रिक खोलने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है5. हालांकि तत्काल ब्लास्टोसिस्ट उत्तरजीविता दर के बाद और वार्मिंग ९०% से ऊपर है, और नैदानिक परिणाम के हस्तांतरण के बाद विरिफाइड/warmed ब्लास्टोसिस्ट गर्भाशय गुहा में लगभग परिणाम के लिए तुलनीय है ताजा के हस्तांतरण के बाद भ्रूण, इस cryopreservation विधि अभी तक मानकीकृत नहीं किया गया है6,7. विरिफिकेशन प्रोटोकॉल (क) प्रकार और cryoprotectants की एकाग्रता के अनुसार बदलती हैं, (ख) previtrification कदम की संख्या, (ग) व्यक्तिगत कदम की अवधि, (घ) एक कृत्रिम blastocoel का उपयोग विक्रिकरण से पहले गिर रहा है या नहीं, (ई) तरीकों को कम करना, (च) ब्लास्टोसिस्ट विस्तार चरण, और (छ) समानता/विरिफिकेशन तापमान जिस पर भ्रूण को8वितरीकृत किया जाना चाहिए । चूंकि cryoprotectants कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकता है, इन समाधानों के लिए ब्लास्टोसिस्ट एक्सपोजर समय अच्छी तरह से परिभाषित किया जाना है. हालांकि, कुछ cryopreservation मीडिया निर्माता बहुत लचीला प्रोटोकॉल की अनुमति दें ।
वैज्ञानिकों के हित आमतौर पर रोपण की एक बेहतर भविष्यवाणी6,9,10के साथ नए बायोमार्कर खोजने के उद्देश्य के साथ ब्लास्टोसिस्ट पुनः विस्तार की क्षमता का अध्ययन करने पर ध्यान केंद्रित किया है । कैसे मानव blastocysts विरिफिकेशन से पहले cryoprotectants जोड़ने और क्या विरिफिकेशन और वार्मिंग, जब cryoprotectants कोशिकाओं से हटा दिया जाना है के बाद blastocysts के साथ होता है के विभिंन चरणों में निर्जलीकरण, और कैसे blastocysts rehydrate और फिर से विस्तार वार्मिंग के बाद, अच्छी तरह से वर्णित है और न ही समझ नहीं है । अलग cryopreservation कदम के दौरान ब्लास्टोसिस्ट व्यवहार के उद्देश्य और मात्रा निर्धारित निगरानी के लिए एक पद्धति का विकास है, इस प्रकार, तर्क ।
समय के साथ विभिन्न निर्माताओं की चूक सूक्ष्मदर्शी, यह अब पूर्व में ब्लास्टोसिस्ट के व्यवहार की निगरानी करने के लिए संभव है-और पोस्ट-विरिफिकेशन चरणों. अतिरिक्त कंप्यूटर टूल्स को शामिल करके, उनके आकार (morphometry) का मापन भी किया जा सकता है । एक निश्चित समय में भ्रूण के आकार में कमी या वृद्धि को मापने के द्वारा, निर्जलीकरण और पुनर्जलयोजन के दौरान भ्रूण की मॉर्फोडायनामिक्स के मूल्यांकन को आपत्तिजनक बनाना संभव है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
के दौरान और cryopreservation के बाद ब्लास्टोसिस्ट morphodynamics के अवलोकन के लिए प्रोटोकॉल भी अन्य निर्माताओं से इसी तरह के उपकरणों और सॉफ्टवेयर उपकरणों का उपयोग करके किया जा सकता है. भ्रूणविज्ञान के लिए समायोजित समय-चू…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम अनुसंधान कार्यक्रम P3-0327 और अनुसंधान परियोजना J3-7177, स्लोवेनियाई अनुसंधान फाउंडेशन द्वारा स्थापित का एक हिस्सा है ।
Materials
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
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