在监测小鼠睡眠/觉醒状态期间对神经环路进行光遗传学操控

摘要

本文介绍了在监测小鼠睡眠/觉醒状态期间，对特定类型神经元进行光遗传学操控的方法，并以我们近期关于终纹床核的研究为例进行说明。

摘要

近年来，光遗传学已广泛应用于神经科学研究的多个领域。在许多情况下，通过病毒载体在多种Cre驱动小鼠的特定类型神经元细胞中表达视蛋白（如通道视紫红质2，ChR2）。这些视蛋白的激活由激光或LED通过光纤传递的光脉冲触发，其激活效应可实现极高时间分辨率的观测。实验人员能够在监测小鼠行为或其他生理结果的同时，对其进行急性神经元刺激。光遗传学技术可为评估神经环路在调控小鼠睡眠/觉醒状态中的功能提供有效的研究策略。本文介绍一种在进行脑电图（EEG）和肌电图（EMG）监测以评估小鼠睡眠阶段的同时，检测具有特定化学特性的神经元经光遗传学操控后效应的技术。作为示例，我们描述了对终纹床核（BNST）中GABA能神经元的操控。在非快速眼动睡眠（NREM睡眠）期间急性光遗传学激活这些神经元，可迅速诱导小鼠转入觉醒状态。结合EEG/EMG记录的光遗传学操控可用于解析调控睡眠/觉醒状态的神经环路。

引言

睡眠对最佳认知功能至关重要。最近的研究还表明，睡眠障碍与多种疾病相关^1,2,3。尽管睡眠的功能在很大程度上仍未完全阐明，但近年来在理解调控睡眠/觉醒状态的神经回路和机制方面已取得显著进展⁴。在哺乳动物中，存在三种警觉状态：觉醒、非快速眼动（NREM）睡眠和快速眼动（REM）睡眠。觉醒的特征是低幅高频的脑电图振荡（5–12 Hz），并伴有有目的且持续的运动活动。NREM睡眠以高幅慢振荡（1–4 Hz，即δ波）为特征，意识丧失，且无目的性运动活动。REM睡眠的特征是低幅相对较快的振荡（6–12 Hz）以及几乎完全的双侧肌肉失张力⁵。

博尔贝利提出了一种关于睡眠-觉醒调节的理论，称为双过程模型^6,7一种稳态过程，也称为S过程，代表在清醒期间累积并在睡眠期间消散的睡眠压力。另一种称为C过程的是昼夜节律过程，用以解释警觉水平为何在24小时周期中发生波动。除了这两个过程外，异稳态因素在睡眠/觉醒的调节中也具有重要作用。^8,<....

方案

本研究所涉及的所有实验均经筑波大学动物实验与使用委员会批准，符合美国国立卫生研究院（NIH）指南。

1. 动物手术、病毒注射、脑电图/肌电图电极及光纤植入

注意：应根据所用病毒的生物安全等级选择适当的防护和操作技术。腺相关病毒（AAV）的注射应在独立的P1A级洁净室中进行，且在用尽全部病毒液后，盛装AAV的管子必须经高压灭菌处理。手术部位及所有植入材料在使用过程中应保持清洁和无菌。
注：参见图1。

1. 使用高压灭菌器对手术器械进行消毒。
2. 使用异氟烷麻醉机对小鼠进行麻醉。观察直至小鼠达到所需的麻醉深度，判断标准为用镊子夹尾无反应。在眼睛上涂抹眼膏以防止角膜干燥。
3. 用碘溶液或70%乙醇对手术区域进行消毒（3次），并充分干燥。手术过程中将病毒置于冰上解冻。用吸水实验台纸覆盖手术区域。
4. 将小鼠头部固定在立体定位仪上，使用耳杆和鼻夹固定。确认头部稳定后，沿矢状方向切开头皮，确保前囟（bregma）和后囟（lambda）位于同一水平线上。
5. 为避免定位偏差，适当上下调节鼻夹和耳杆的高度。前囟和后囟分别指矢状缝与冠状缝或人字缝的交点（图2

结果

本研究展示了光遗传学激活BNST中GABA^BNST神经元对睡眠状态转换的影响。ChR2-EYFP在BNST的GABA神经元中实现局灶性表达。原位杂交组织化学实验显示，ChR2-EYFP与表达GAD 67 mRNA信号的神经元共定位，表明这些神经元属于GABA能神经元。免疫组织化学脑片样本证实了光纤的位置，其尖端恰好位于BNST上方²⁵。

图3A 显示了非快速眼动（NREM）睡眠期间光刺激前后具有代表性的脑电图（EEG）/肌电图（EMG）记录。高电压、低频率的脑电图信号且无肌电图信号代表处于NREM睡眠状态。在NREM睡眠稳定后，施加光刺激（20 Hz、10 ms脉冲，持续20秒）。在表达ChR2的小鼠中，刺激后约2秒即引发急性觉醒反应（低电压、高频率脑电图信号伴随活跃的肌电图信号）。对照小鼠（EYFP）在刺激后未出现觉醒转换.......

讨论

本文介绍了一种评估特定化学类型神经元光遗传学刺激对睡眠/觉醒状态转换影响的方法，并以操控GABA能神经元为例进行了演示^BNST 神经元。我们的数据显示，对GABA进行光遗传学兴奋^BNST 神经元导致从非快速眼动睡眠立即转变为觉醒状态。

由于多种光遗传学工具的开发，现已可采用多种实验设计。利用不同类型的视蛋白（如 ChR2、SSFO、halorhodopsin、ArchT 和 iChloC²⁷），可以激活或抑制特定神经元的神经活动。ChR2 在光刺激后数毫秒内即可激活神经元，可通过脉冲发生器以锁相方式诱发动作电位，从而研究其在特定睡眠阶段的急性效应。而诸如稳定阶跃函数视蛋白（stable step function opsin, SSFO）等可持续激活的视蛋白，在刺激后可使神经元去极化持续 15 至 30 分钟，适用于观察半慢性效应的某些实验设计²⁸。经 SSFO 去极化的细胞可能对多种生理性神经输入更为敏感，并可通过施加长波长光加以抑制。此外，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x1 光纤旋转接头	Doric	FRJ 1x1 FC-FC	用于光遗传学
6 针插头	KEL corporation	DSP02-006-431G
6 针插座	Hirose	21602X3GSE
A/D 转换器	Nippon koden	N/A	模拟信号转数字信号转换器
AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP			3.70×1013（基因组拷贝数/mL）
AAV10-EF1a-DIO-EYFP			5.82×1013（基因组拷贝数/mL）
氨苄青霉素	Fuji film	014-23302
放大器	Nippon koden	N/A	用于脑电图/肌电图记录
麻醉气体蒸发器	Muromachi	MK-AT-210D
自动注射器	KD scientific	780311
碳化钨切割钻头	Minitor	B1055	φ0.7 mm。又称牙科钻头，与高速旋转微型电机配合使用
氰基丙烯酸酯粘合剂 （Aron alpha A）及加速剂	Konishi	#30533
牙科光固化灯	3M	Elipar S10
环氧树脂粘合剂	Konishi	#04888	用于6针插头与屏蔽电缆焊接处的绝缘
光纤跳线（分路型）	Doric	BFP(#)_50/125/900-0.22
Gad67-Cre 小鼠	由坂村健二博士提供		Cre 重组酶基因被敲入 Gad67 等位基因中
哈密尔顿注射器	Hamilton	65461-01
高速旋转微型电机套件	FOREDOM	K.1070	与碳化钨切割钻头配合使用
连接套管	Thorlab	ADAF1	φ2.5 mm 陶瓷材质
异氟烷	Pfizer	871119
激光器	Rapp OptoElectronic	N/A	波长 473 nm
激光强度检测仪	COHERENT	1098293
激光刺激器	生物研究中心	STO2	文中称为脉冲发生器
带插芯的光纤	Thorlab	FP200URT-CANNULA-SP-JP
pAAV2-rh10	由 PennVector Core 提供
pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA	Addgene	质粒 # 20296
pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA	由 Karl Deisseroth 博士提供
跳线	Doric	D202-9089-0.4	长度 0.4 m，用于激光器与旋转接头之间的激光传导
pHelper	Stratagene
光固化牙科水泥	3M	56846
Serafin 夹具	Stoelting	52120-43P
屏蔽电缆	mogami	W2780	用于与6针插座焊接，以记录脑电图/肌电图
睡眠记录室	N/A	N/A	定制（21 cm× 29 cm × 19 cm），带水箱支架
Sleep Sign 软件	KISSEI COMTEC	N/A	用于脑电图/肌电图分析
滑环	neuroscience,inc	N/A	用于脑电图/肌电图分析
不锈钢螺钉	Yamazaki	N/A	φ1.0 x 2.0
不锈钢导线	Cooner wire	AS633	直径 0.0130 英寸
带数字控制台的立体定位仪	Koph	N/A	型号 940
注射器针头	Hamilton	7803-05
Vital Recorder 软件	KISSEI COMTEC	N/A	用于脑电图/肌电图记录