Optogenetische Manipulation von neuronalen Schaltkreisen während der Überwachung von Schlaf-/Wachzustanden bei Mäusen
Summary
Hier beschreiben wir Methoden der optogenetischen Manipulation bestimmter Arten von Neuronen bei der Überwachung von Schlaf-/Wachzustanden bei Mäusen und stellen unsere jüngsten Arbeiten am Bettkern der Stria terminalis als Beispiel vor.
Abstract
In den letzten Jahren wurde die Optogenetik in vielen Bereichen der neurowissenschaftlichen Forschung weit verbreitet. In vielen Fällen wird ein Opsin, wie Kanal Rhodopsin 2 (ChR2), durch einen Virusvektor in einer bestimmten Art von neuronalen Zellen in verschiedenen Cre-Driver-Mäusen exprimiert. Die Aktivierung dieser Opsine wird durch die Anwendung von Lichtimpulsen ausgelöst, die per Laser oder LED über optische Kabel geliefert werden, und die Wirkung der Aktivierung wird mit sehr hoher Zeitauflösung beobachtet. Experimentatoren sind in der Lage, Neuronen akut zu stimulieren, während sie das Verhalten oder ein anderes physiologisches Ergebnis bei Mäusen überwachen. Optogenetik kann nützliche Strategien ermöglichen, um die Funktion neuronaler Schaltkreise bei der Regulierung von Schlaf-/Wachzustanden bei Mäusen zu bewerten. Hier beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung der Wirkung der optogenetischen Manipulation von Neuronen mit einer spezifischen chemischen Identität während der Elektroenzephalogramm- (EEG) und Elektromyogramm-Überwachung (EMG) zur Bewertung des Schlafstadiums von Mäusen. Als Beispiel beschreiben wir die Manipulation von GABAergen Neuronen im Bettkern der Stria terminalis (BNST). Akute optogenetische Erregung dieser Neuronen löst einen schnellen Übergang zur Wachheit aus, wenn sie während des NREM-Schlafes angewendet wird. Optogenetische Manipulation zusammen mit EEG/EMG-Aufzeichnung kann angewendet werden, um die neuronalen Schaltkreise zu entschlüsseln, die Schlaf-/Wachzustand regulieren.
Introduction
Schlaf ist wichtig für eine optimale kognitive Funktion. Jüngste Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass Schlafstörungen mit einer Vielzahl von Krankheiten verbunden sind1,2,3. Obwohl die Funktionen des Schlafes noch weitgehend ungelöst sind, wurden in letzter Zeit wesentliche Fortschritte beim Verständnis der neuronalen Schaltkreise und Mechanismen erzielt, die Schlaf-/Wachzustande steuern4. Bei Säugetieren gibt es drei Zustände der Wachsamkeit: Wachheit, Nicht-schnelle Augenbewegung (NREM) Schlaf, und schnelle Augenbewegung (REM) Schlaf. Wachheit zeichnet sich durch schnelle EEG-Oszillationen (5-12 Hz) niedriger Amplitude mit gezielter und anhaltender motorischer Aktivität aus. NREM-Schlaf wird durch langsame Schwingungen (1-4 Hz) hoher Amplitude (Deltawellen) mit Bewusstseinsmangel und zielgerichteter motorischer Aktivität definiert. REM-Schlaf zeichnet sich durch relativ schnelle Schwingungen (6-12 Hz) niedriger Amplitude und fast vollständiger bilateraler Muskulatur5aus.
Borbely schlug eine Theorie der Schlaf-Wachigkeit-Regulierung bekannt als die beiden Prozessmodell6,7. Ein atostatischer Prozess, auch Prozess S genannt, stellt Schlafdruck dar, der sich während der Wachheit ansammelt und sich während des Schlafes auflöst. Ein weiterer Prozess, der als Prozess C bezeichnet wird, ist ein zirkadianer Prozess, der erklärt, warum die Wachsamkeit im 24-Stunden-Zyklus schwankt. Zusätzlich zu diesen beiden Prozessen sind allostatische Faktoren auch wichtig für die Regulierung von Schlaf/Wachheit8,9. Allostatische Faktoren sind Ernährungszustände und Emotionen. Angst und Angst werden in der Regel von einer Zunahme der Erregung zusammen mit autonomen und neuroendokrinen Reaktionen10,11,12begleitet. Es wird angenommen, dass das limbische System eine Rolle bei der Regulierung von Angst und Angst spielt, und Mechanismen, die autonomen und neuroendokrinen Reaktionen zugrunde liegen, wurden ausgiebig untersucht, aber der Weg, durch den das limbische System Schlaf-/Wachzustande beeinflusst, hat noch enthüllt. Eine große Anzahl neuerer Studien mit Opto- und Pharmakogenetik haben gezeigt, dass Neuronen und neuronale Schaltkreise, die Schlaf-/Wachzustande regulieren, im gesamten Gehirn verteilt sind, einschließlich der Kortiken, Basalvorhirn, Thalamus, Hypothalamus, und Hirnstamm. Insbesondere die jüngsten Fortschritte in der Optogenetik haben es uns ermöglicht, bestimmte neuronale Schaltkreise in vivo mit hohen räumlichen und zeitlichen Auflösungen zu stimulieren oder zu hemmen. Diese Technik ermöglicht Fortschritte in unserem Verständnis der neuronalen Substrate von Schlaf und Wachheit, und wie Schlaf / Wachheit Zustände durch zirkadiane Prozesse reguliert werden, Schlafdruck, und allostatische Faktoren, einschließlich Emotionen. Dieses Papier zielt darauf ab, einzuführen, wie optogenetische Manipulation kombiniert mit Schlaf/Wach-Aufzeichnung verwendet werden kann, die das Potenzial haben könnte, unser Verständnis der Verbindungen und Mechanismen im Gehirn zu aktualisieren, die eine Rolle bei der Regulierung von NREM-Schlaf, REM-Schlaf, und Wachheit. Das Verständnis dieses Mechanismus, durch den das limbische System Schlaf-/Wachzustandreguliert, ist von größter Bedeutung für die Gesundheit, da Schlaflosigkeit in der Regel mit Angst oder Angst verbunden ist, nicht schlafen zu können (Somniphobie).
Die BNST wird gedacht, um eine wesentliche Rolle in Angst und Angst zu spielen. GAD 67-exeziniert GABAerge Neuronen sind eine Hauptpopulation der BNST12,13. Wir untersuchten die Wirkung der optogenetischen Manipulation dieser Neuronen (GABABNST) auf Schlaf/Wachheit Zustände. Einer der größten Fortschritte in der Neurowissenschaft in den letzten Jahren waren Methoden, die die Manipulation von Neuronen mit bestimmten chemischen Identitäten in vivo mit hohen räumlichen und zeitlichen Auflösungen ermöglichen. Optogenetik ist sehr nützlich, um kausale Zusammenhänge zwischen neuronaler Aktivität und spezifischen Verhaltensreaktionen zu demonstrieren14. Wir beschreiben die Optogenetik als eine Methode, um die funktionelle Konnektivität definierter neuronaler Schaltkreise bei der Regulierung von Schlaf-/Wachzustanden zu untersuchen. Durch die Verwendung dieser Technik, große Fortschritte wurden beim Verständnis der neuronalen Schaltkreise, die Schlaf / Wachheit Zustände regulieren15,16,17,18,19 . In vielen Fällen werden Opsine speziell in Neuronen mit besonderen chemischen Identitäten in selektiven Hirnregionen durch eine Kombination von Cre-Driver-Mäusen und Cre-induzierbarem AAV-vermitteltem Gentransfer eingeführt. Darüber hinaus ermöglicht die fokale Expression von lichtempfindlichen Opsinen wie Channelrhodopsin 2 (ChR2)20 oder Archaerhodopsin (ArchT)21 in Kombination mit einem Cre-loxP- oder Flp-FRT-System neuronalen Weg22.
Wir beschreiben hier Experimente an GABAergen Neuronen im BNST als Beispiel. Um Opsine in einer bestimmten neuronalen Population auszudrücken, werden am häufigsten geeignete Cre-Treibermäuse und Cre-abhängige Virusvektoren verwendet. Transgene oder Knock-in-Linien, in denen Opsine in bestimmten neuronalen Populationen exprimiert werden, sind ebenfalls nützlich. In den folgenden Experimenten verwendeten wir GAD67-Cre-Knock-in-Mäuse23, bei denen nur GABAerge Neuronen Cre-Rekombination mit einem c57BL/6J genetischen Hintergrund und einen AAV-Vektor, der ChR2 (hChR2 H134R) enthält, mit EYFP oder EYFP als Kontrolle verschmelzen mit einem “FLEx (Flip-Excision) Schalter”24. Das Verfahren beschreibt speziell optogenetische Anregung von GABAergen Neuronen im BNST während der Überwachung von Schlaf / Wachheit Zustände25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir stellten hier eine Methode vor, um die Wirkung der optogenetischen Stimulation von Neuronen mit bestimmten chemischen Identitäten auf Zustandsübergänge von Schlaf/Wachheit zu bewerten und gaben ein Beispiel für die Manipulation von GABABNST Neuronen. Unsere Daten zeigten, dass optogenetische Anregung von GABABNST Neuronen führt zu sofortigen Übergang von NREM Schlaf zu Wachheit.
Verschiedene experimentelle Designs sind aufgrund der Entwicklung von zahlreichen Ar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch das Merck Investigator Studies Program (#54843), ein KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas, “WillDynamics” (16H06401) (T.S.) und ein KAKENHI Grant-in-Aid for Exploratory Research on Innovative Areas (T.S.) (18H02595).
Materials
| 1×1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1×1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
References
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