Manipulação optogenetic de circuitos neural durante a monitoração sono/Estados do wakefulness nos ratos
Summary
Aqui, nós descrevemos métodos da manipulação optogenética de tipos particulares de neurônios durante a monitoração de Estados do sono/wakefulness nos ratos, apresentando nosso trabalho recente no núcleo da cama do terminalis do stria como um exemplo.
Abstract
Nos últimos anos, a optogenética tem sido amplamente utilizada em muitos campos da pesquisa neurocientífica. Em muitos casos, um opsin, tal como a canaleta rodopsina 2 (ChR2), é expressado por um vetor do vírus em um tipo particular de pilhas neuronal em vários ratos do CRE-excitador. A ativação desses opsinas é desencadeada pela aplicação de pulsos leves que são entregues por laser ou LED através de cabos ópticos, e o efeito da ativação é observado com resolução de tempo muito alta. Os experimentadores são capazes de estimular agudamente os neurônios enquanto monitoram o comportamento ou outro resultado fisiológico em camundongos. A optogenética pode permitir estratégias úteis para avaliar a função dos circuitos neuronais na regulação dos Estados de sono/vigília em camundongos. Aqui nós descrevemos uma técnica para examinar o efeito da manipulação optogenética dos neurônios com uma identidade química específica durante o eletroencefalograma (EEG) e a monitoração do electromyogram (EMG) para avaliar o estágio do sono dos ratos. Como um exemplo, nós descrevemos a manipulação de neurônios GABAergic no núcleo da cama do terminalis do stria (BNST). A excitação optogenética aguda desses neurônios desencadeia uma rápida transição para a vigília quando aplicada durante o sono NREM. A manipulação optogenetic junto com a gravação de EEG/EMG pode ser aplicada para decifrar os circuitos neuronal que regulam Estados do sono/wakefulness.
Introduction
O sono é essencial para a função cognitiva ideal. Achados recentes também sugerem que distúrbios no sono estão associados a uma ampla gama de doenças1,2,3. Embora as funções do sono sejam ainda largamente não resolvidas, o progresso substancial foi feito recentemente em compreender os circuitos e os mecanismos neural que controlam Estados do sono/vigília4. Nos mamíferos, há três Estados de vigilância: vigília, sono não-rápido do movimento de olho (NREM), e sono rápido do movimento de olho (REM). A vigília é caracterizada por oscilações rápidas de EEG (5-12 Hz) de baixa amplitude com atividade motora proposital e sustentada. O sono NREM é definido por oscilações lentas (1-4 Hz) de alta amplitude (ondas delta), com falta de consciência e atividade motora proposital. O sono REM é caracterizado por oscilações relativamente rápidas (6-12 Hz) de baixa amplitude e atonia muscular bilateral quase completa5.
Borbely propôs uma teoria da regulação do sono-vigília conhecida como o modelo de dois processos6,7. Um processo homeostático, também conhecido como processo S, representa a pressão do sono que se acumula durante A vigília e se dissipa durante o sono. Outro processo, referido como processo C, é um processo circadiano, o que explica por que os níveis de vigilância flutuam no ciclo de 24 h. Além desses dois processos, fatores alopáticos também são importantes para a regulação do sono/vigília8,9. Fatores alopáticos incluem Estados nutricionais e emoção. O medo e a ansiedade geralmente são acompanhados por um aumento da excitação junto com as respostas autonômicas e neuroendócrinas10,11,12. Acredita-se que o sistema límbico desempenhe um papel na regulação do medo e da ansiedade, e os mecanismos subjacentes às respostas autonômicas e neuroendócrinas têm sido estudados extensivamente, mas o caminho pelo qual o sistema límbico influencia os Estados de sono/vigília não tem ainda foi revelado. Um grande número de estudos recentes usando opto e farmacogenética sugeriram que os neurônios e os circuitos neuronais que regulam os Estados de sono/vigília são distribuídos por todo o cérebro, incluindo os córtices, o forebrain basal, o tálamo, o hipotálamo, e tronco cerebral. Em particular, os recentes avanços na optogenética nos permitiram estimular ou inibir circuitos neurais específicos in vivo com altas resoluções espaciais e temporais. Esta técnica permitirá o progresso em nosso entendimento dos substratos neurais do sono e vigília, e como os Estados de sono/vigília são regulados por processos circadianos, pressão do sono, e fatores alopáticos, incluindo a emoção. Este artigo tem como objetivo apresentar como usar a manipulação optogenética combinada com gravação de sono/vigília, o que poderia ter o potencial de atualizar nossa compreensão dos conectomes e mecanismos no cérebro que desempenham um papel na regulação do sono NREM, sono REM, e vigília. A compreensão deste mecanismo pelo qual o sistema límbico regula os Estados de sono/vigília é de suma importância para a saúde, porque a insônia é geralmente associada com ansiedade ou medo de ser incapaz de dormir (somniphobia).
O BNST é pensado para desempenhar um papel essencial na ansiedade e no medo. Gad 67-expressar os neurônios gabaérgicos são uma grande população do BNST12,13. Nós examinamos o efeito da manipulação optogenética destes neurônios (GABABNST) em Estados do sono/wakefulness. Um dos maiores avanços na neurociência nos últimos anos tem sido métodos que possibilitam a manipulação de neurônios com identidades químicas particulares in vivo, com altas resoluções espaciais e temporais. A optogenética é altamente útil para demonstrar vínculos causais entre a atividade neural e as respostas comportamentais específicas14. Nós descrevemos o optogenetics como um método para examinar a conectividade funcional de circuitos neural definidos na regulação de Estados do sono/vigília. Utilizando essa técnica, grandes avanços foram alcançados na compreensão dos circuitos neuronais que regulam os Estados de sono/vigília15,16,17,18,19 . Em muitos casos, os opsinas são introduzidos especificamente nos neurônios com as identidades químicas particulares em regiões seletivas do cérebro por uma combinação de ratos do CRE-excitador e transferência AAV-negociada CRE-inducible do gene. Mais, a expressão focal de opsinas foto-sensíveis tais como o channelrhodopsin 2 (ChR2)20 ou o archaerhodopsin (archt)21 combinados com um sistema de CRE-Loxp ou de FLP-FRT permitem-nos de manipular uma população neuronal seletiva e um específico via neural22.
Nós descrevemos aqui experiências em neurônios GABAergic no BNST como um exemplo. Para expressar opsinas em uma população neuronal designada, os ratos apropriados do excitador de CRE e os vetores CRE-dependentes do vírus são usados o mais freqüentemente. As linhas transgénicas ou de Knock-in em que os opsinas são expressos em populações neuronal particulares são igualmente úteis. Nos experimentos a seguir, utilizamos camundongos Knock-in GAD67-CRE 23 em que apenas os neurônios gabaérgicos expressam CRE recombinase com um fundo genético C57Bl/6J, e um vetor AAV que contém ChR2 (hChR2 H134R) fundido com eyfp ou eyfp como um controle com um “interruptor FLEx (Flip-excisão)”24. O procedimento descreve especificamente a excitação optogenética de neurônios gabaergic no BNST durante a monitoração de Estados do sono/vigília25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós apresentamos aqui um método para avaliar o efeito da estimulação optogenética dos neurônios com as identidades químicas particulares em transições do estado do sono/vigília e deu um exemplo da manipulação de neurônios de GABABNST . Nossos dados mostraram que a excitação optogenética de neurônios de GABABNST conduz à transição imediata do sono de NREM ao wakefulness.
Os vários projetos experimentais estão disponíveis por causa do desenvolvimento …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo programa de estudos do investigador da Merck (#54843), um subsídio de ajuda de KAKENHI para pesquisa científica sobre áreas inovadoras, “WillDynamics” (16H06401) (TS), e um subsídio de KAKENHI para pesquisa exploratória em áreas inovadoras (TS) (18H02595).
Materials
| 1×1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1×1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
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