마우스에서 수면/각성 상태를 모니터링하는 동안 신경 회로의 광유전학 적 조작
Summary
여기에서, 우리는 마우스에 있는 잠/각성 상태의 감시 도중 뉴런의 특정 모형의 광유전학 조작의 방법을 기술합니다, 예를 들면 stria 말단의 침대 핵에 우리의 최근 일을 제시하.
Abstract
최근 몇 년 동안, 광유전학널리 신경 과학 연구의 많은 분야에서 사용되어왔다. 많은 경우에, 채널 로독신 2(ChR2)와 같은 opsin은 다양한 Cre-driver 마우스에서 특정 유형의 뉴런 세포에서 바이러스 벡터에 의해 발현된다. 이러한 opsins의 활성화는 광학 케이블을 통해 레이저 또는 LED에 의해 전달되는 광 펄스의 응용 프로그램에 의해 트리거되며, 활성화의 효과는 매우 높은 시간 해상도로 관찰된다. 실험자는 쥐에 있는 행동 또는 다른 생리적인 결과를 감시하는 동안 신경세포를 급격하게 자극할 수 있습니다. 광유전학은 마우스에 있는 잠/각성 상태의 규칙에 있는 신경 회로의 기능을 평가하는 유용한 전략을 가능하게 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 마우스의 수면 단계를 평가하기 위하여 뇌전도 (EEG) 및 근전도 (EMG) 감시 도중 특정 화학 동일성을 가진 뉴런의 광유전학 조작의 효력을 검토하기 위한 기술을 기술합니다. 일례로, 우리는 줄무늬 말단의 침대 핵에 있는 GABAergic 뉴런의 조작을 기술합니다 (BNST). 이러한 뉴런의 급성 광유전학적 흥분은 NREM 수면 중에 적용될 때 깨어있는 것으로 급속한 전이를 유발합니다. EEG/EMG 기록과 함께 광유전학적 조작은 수면/깨어 상태를 조절하는 신경 회로를 해독하기 위해 적용될 수 있습니다.
Introduction
수면은 최적의 인지 기능에 필수적입니다. 최근 연구 결과는 또한 수면 장애가 광범위한 질병 1,2,3과관련이 있음을 시사합니다. 수면의 기능은 아직 크게 해결되지 않았지만, 수면/각성 상태를 제어하는 신경 회로 및 메커니즘을 이해하는 데 상당한진전이 최근 이루어졌다 4. 포유류에서는, 경계의 3개의 국가가 있습니다: 깨어, 비 급속한 눈 운동 (NREM) 잠 및 급속한 눈 운동 (REM) 잠. 깨어있는 것은 의도적이고 지속적인 운동 활동과 낮은 진폭의 빠른 EEG 진동 (5-12 Hz)을 특징으로합니다. NREM 수면은 의식 부족과 의도적인 운동 활동으로 높은 진폭 (델타 파)의 느린 진동 (1-4 Hz)에 의해 정의됩니다. REM 수면은 낮은 진폭과 거의 완전한 양측 근육 원반5의 비교적 빠른 진동 (6-12 Hz)을 특징으로합니다.
Borbely는 두 개의 프로세스 모델6,7로알려진 수면 – 깨어 조절의 이론을 제안했다. 프로세스 S라고도 하는 시간성 과정은 깨어 있는 동안 축적되고 수면 중에 사라지는 수면 압력을 나타냅니다. 프로세스 C라고 도하는 또 다른 프로세스는 circadian 프로세스로, 경계 수준이 24 시간 주기에서 변동하는 이유를 설명합니다. 이 두 가지 과정 이외에, 종전성 요인은 또한 수면/각성 조절에 중요하다8,9. 전압적 요인은 영양 상태와 감정을 포함한다. 공포와 불안은 일반적으로 자율 및 신경 내분비 반응과함께 각성의 증가를 동반10,11,12. 변연계는 공포와 불안의 규칙에 있는 역할을 하기 위하여 믿어지고, 자율 및 신경 내분비 반응의 근본적인 기계장치는 광범위하게 공부되었습니다, 그러나 변연계가 잠/각성 상태에 영향을 미치는 통로는 아닙니다 아직 밝혀지지 않았습니다. 광유전학 및 약리유전학을 이용한 최근 연구의 많은 수의 뉴런과 수면/깨어 상태를 조절하는 뉴런 회로가 코르티칼, 기저 전뇌, 시상 하부, 시상 하부, 뇌간. 특히, 광유전학의 최근 발전은 우리가 높은 공간 및 시간적 해상도로 특정 신경 회로 in vivo를 자극하거나 억제할 수 있게 해 주었으며, 그 중에서도 이러한 발전은 우리가 자극하거나 억제할 수 있게 해 주었으며, 그 중에서도 이러한 광유전학은 우리가 자극하거나 억제할 수 있게 해 주어있다. 이 기술은 수 면과 깨어의 신경 기판의 우리의 이해에 진행을 허용 합니다., 그리고 어떻게 수 면/깨어 상태 circadian 프로세스에 의해 조절 됩니다., 수 면 압력, 그리고 감정을 포함 하 여 allostatic 요인. 이 논문은 NREM 수면, REM 수면의 조절에 역할을하는 뇌의 커토머스 및 메커니즘에 대한 우리의 이해를 업데이트 할 수있는 수면 / 각성 기록과 결합 된 광유전학 적 조작을 사용하는 방법을 소개하는 것을 목표로합니다. 그리고 깨어. 불면증은 일반적으로 불안 또는 잠을 잘 수 없는의 두려움과 관련 되어 있기 때문에 변연 성 시스템 수 면/각 성 상태를 조절 하는이 메커니즘의 이해는 건강에 가장 중요 한, (somniphobia).
BNST는 불안과 두려움에 필수적인 역할을 할 것으로 생각됩니다. GAD67-발현 GABAergic 뉴런은 BNST12,13의주요 인구이다. 우리는 수면 / 깨어 상태에 이러한 뉴런 (GABABNST)의광유전학 적 조작의 효과를 조사했다. 최근 몇 년 동안 신경 과학에서 가장 큰 발전 중 하나는 생체 내에서 특정 화학 정체성을 가진 뉴런의 조작을 가능하게하는 방법이었다, 높은 공간 및 시간 적 해상도. 광유전학은 신경 활동과 특정 행동 반응 사이의 인과 관계를 입증하는 데 매우 유용합니다14. 우리는 수면/깨어 상태의 조절에 정의된 신경 회로의 기능적 연결을 검사하는 방법으로 광유전학을 기술합니다. 이 기술을 활용하여 수면/각성 상태를 조절하는 신경 회로를 이해하는 데 큰 진전이 이루어졌습니다15,16,17,18,19 . 많은 경우에, opsins는 Cre-driver 마우스와 Cre-유도성 AAV 매개 유전자 전송의 조합에 의해 선택적 두뇌 지구에 있는 특정 화학 정체성을 가진 뉴런에서 특히 소개됩니다. 또한, 채널로정형신 2(ChR2)20 또는 아카호도신(ArchT)21과 같은 광에 민감한 옵신의 초점 발현을 Cre-loxP 또는 Flp-FRT 시스템과 결합하여 선택적 뉴런 집단 및 특정을 조작할 수 있습니다. 신경 통로22.
우리는 예를 들어 BNST에서 GABAergic 뉴런에 여기 실험을 설명. 지정된 뉴런 집단에서 opsins를 발현하기 위해, 적절한 Cre 드라이버 마우스 및 Cre 의존성 바이러스 벡터가 가장 자주 사용된다. opsins가 특히 신경 인구에서 표현되는 형질 전환 또는 노크 인 선은 또한 유용합니다. 다음 실험에서는 GABAergic 뉴런만이 C57BL/6J 유전적 배경으로 크레조합을 발현하는 GAD67-Cre 노크인 마우스23과 EYFP 또는 EYFP와 융합된 ChR2(hChR2 H134R)를 포함하는 AAV 벡터를 대조군으로 사용했습니다. “FLEx (플립 절제)스위치”24. 절차는 특히 수 면/깨어 상태의 모니터링 하는 동안 BNST에서 GABAergic 뉴런의 optogenetic 여기를 설명25.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 여기에서 잠/각성의 국가 전환에 특정 화학 정체성을 가진 뉴런의 광유전학 자극의 효력을 평가하는 방법을 제시하고 GABABNST 뉴런의 조작의 보기를 주었습니다. 우리의 데이터는 GABABNST 뉴런의 광유전학 적 흥분은 NREM 수면에서 깨어있는 즉각적인 전환을 초래한다는 것을 보여주었습니다.
다양한 실험 설계는 광유전학 적 도구의 수많은 유형의 개발로 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 머크 조사자 연구 프로그램 (#54843), 혁신적인 영역에 대한 과학적 연구를위한 KAKENHI 보조금 지원, “윌다이내믹스”(16H06401) (T.S.), 그리고 혁신적인 영역에 대한 탐사 연구를위한 KAKENHI 그랜트 인 에이드 (T.S.) (18H02595).
Materials
| 1×1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1×1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
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