Manipulation optogénétique des circuits neuronaux pendant la surveillance des états de sommeil/éveil chez les souris
Summary
Ici, nous décrivons des méthodes de manipulation optogénétique de types particuliers de neurones pendant la surveillance des états de sommeil/éveil chez les souris, présentant nos travaux récents sur le noyau de lit de la stria terminalis comme exemple.
Abstract
Ces dernières années, l’optogénétique a été largement utilisée dans de nombreux domaines de la recherche neuroscientifique. Dans de nombreux cas, une opsine, comme la rhodopsine 2 (ChR2), est exprimée par un vecteur de virus dans un type particulier de cellules neuronales chez diverses souris Cre-driver. L’activation de ces opsines est déclenchée par l’application d’impulsions lumineuses qui sont délivrées par laser ou LED par des câbles optiques, et l’effet de l’activation est observé avec une résolution de temps très élevée. Les expérimentateurs sont en mesure de stimuler les neurones de façon aigue tout en surveillant le comportement ou un autre résultat physiologique chez la souris. L’optogénétique peut permettre des stratégies utiles pour évaluer la fonction des circuits neuronaux dans la régulation des états de sommeil/éveil chez la souris. Ici nous décrivons une technique pour examiner l’effet de la manipulation optogénétique des neurones avec une identité chimique spécifique pendant la surveillance d’électroencéphalogramme (EEG) et d’électromyogramme (EMG) pour évaluer le stade de sommeil des souris. Par exemple, nous décrivons la manipulation des neurones GABAergic dans le noyau de lit du terminalis de stria (BNST). L’excitation optogénétique aigue de ces neurones déclenche une transition rapide à l’éveil une fois appliqué pendant le sommeil de NREM. La manipulation optogénétique ainsi que l’enregistrement EEG/EMG peuvent être appliqués pour déchiffrer les circuits neuronaux qui régulent les états de sommeil/éveil.
Introduction
Le sommeil est essentiel pour une fonction cognitive optimale. Des résultats récents suggèrent également que les perturbations dans le sommeil sont associées à un large éventail de maladies1,2,3. Bien que les fonctions du sommeil ne soient pas encore encore en grande partie résolues, des progrès substantiels ont été réalisés récemment dans la compréhension des circuits neuronaux et des mécanismes qui contrôlent les états de sommeil/éveil4. Chez les mammifères, il y a trois états de vigilance : l’éveil, le sommeil non rapide des mouvements oculaires (NREM) et le sommeil rapide des yeux (REM). L’éveil est caractérisé par des oscillations rapides d’EEG (5-12 Hz) de basse amplitude avec l’activité motrice intentionnelle et soutenue. Le sommeil NREM est défini par des oscillations lentes (1-4 Hz) de haute amplitude (ondes delta), avec un manque de conscience et une activité motrice ciblée. Le sommeil paradoxal est caractérisé par des oscillations relativement rapides (6-12 Hz) de faible amplitude et presque complète atonia musculaire bilatérale5.
Borbely a proposé une théorie de la régulation de l’éveil du sommeil connue sous le nom de modèle à deux processus6,7. Un processus homéostatique, également appelé processus S, représente la pression du sommeil qui s’accumule pendant l’éveil et se dissipe pendant le sommeil. Un autre processus, appelé processus C, est un processus circadien, ce qui explique pourquoi les niveaux de vigilance fluctuent dans le cycle de 24 h. En plus de ces deux processus, les facteurs allostatiques sont également importants pour la régulation du sommeil / éveil8,9. Les facteurs allostatiques incluent les états nutritionnels et l’émotion. La peur et l’anxiété sont généralement accompagnées d’une augmentation de l’excitation ainsi que des réponses autonomes et neuroendocrines10,11,12. Le système limbique est censé jouer un rôle dans la régulation de la peur et de l’anxiété, et les mécanismes sous-jacents aux réponses autonomes et neuroendocrines ont été étudiés en profondeur, mais la voie par laquelle le système limbique influence le sommeil / état d’éveil n’a pas encore été révélé. Un grand nombre d’études récentes utilisant l’opto- et la pharmacogénétique ont suggéré que les neurones et les circuits neuronaux qui régulent les états de sommeil/éveil sont distribués dans tout le cerveau, y compris les cortices, le cerveau avant basal, le thalamus, l’hypothalamus, et le tronc cérébral. En particulier, les progrès récents dans l’optogénétique nous ont permis de stimuler ou d’inhiber des circuits neuronaux spécifiques in vivo avec des résolutions spatiales et temporelles élevées. Cette technique permettra de progresser dans notre compréhension des substrats neuronaux du sommeil et de l’éveil, et comment les états de sommeil/éveil sont réglés par les processus circadiens, la pression du sommeil et les facteurs allostatiques, y compris l’émotion. Cet article vise à introduire comment utiliser la manipulation optogénétique combinée avec l’enregistrement du sommeil / veille, qui pourrait avoir le potentiel de mettre à jour notre compréhension des connectomes et des mécanismes dans le cerveau qui jouent un rôle dans la régulation du sommeil NREM, sommeil paradoxal, et l’éveil. La compréhension de ce mécanisme par lequel le système limbique régule les états de sommeil/éveil est d’une importance primordiale pour la santé, parce que l’insomnie est habituellement associée à l’anxiété ou à la peur d’être incapable de dormir (somniphobie).
On pense que le BNST joue un rôle essentiel dans l’anxiété et la peur. GAD 67-exprimant les neurones GABAergic sont une population importante de la BNST12,13. Nous avons examiné l’effet de la manipulation optogénétique de ces neurones (GABABNST) sur les états de sommeil/éveil. L’une des plus grandes avancées en neurosciences ces dernières années a été des méthodes qui permettent la manipulation de neurones avec des identités chimiques particulières in vivo, avec des résolutions spatiales et temporelles élevées. L’optogénétique est très utile pour démontrer les liens de causalité entre l’activité neuronale et les réponses comportementales spécifiques14. Nous décrivons l’optogénétique comme méthode pour examiner la connectivité fonctionnelle des circuits neuronaux définis dans la régulation des états de sommeil/éveil. En utilisant cette technique, de grands progrès ont été réalisés dans la compréhension des circuits neuronaux qui régulent le sommeil / éveil états15,16,17,18,19 . Dans de nombreux cas, les opsines sont spécifiquement introduites dans les neurones avec des identités chimiques particulières dans les régions sélectives du cerveau par une combinaison de souris Cre-driver et Cre-inductible AAV-négocié le transfert de gène. En outre, l’expression focale d’opsines photosensibles telles que la canalrhodopsine 2 (ChR2)20 ou l’archaerhodopsine (ArchT)21 combinée à un système Cre-loxP ou Flp-FRT nous permet de manipuler une population neuronale sélective et spécifique voie neuronale22.
Nous décrivons ici des expériences sur des neurones GABAergic dans le BNST comme exemple. Pour exprimer des opsines dans une population neuronale désignée, des souris de conducteur de Cre appropriées et des vecteurs de virus Cre-dépendants sont le plus fréquemment utilisés. Les lignes transgéniques ou knock-in dans lesquelles les opsines sont exprimées en particulier les populations neuronales sont également utiles. Dans les expériences suivantes, nous avons utilisé GAD67-Cre knock-in souris23 dans lequel seuls les neurones GABAergic exprimer Cre recombinase avec un fond génétique C57BL/6J, et un vecteur AAV qui contient ChR2 (hChR2 H134R) fusionné avec EYFP ou EYFP comme un contrôle avec un commutateur “FLEx (Flip-excision)”24. La procédure décrit spécifiquement l’excitation optogénétique des neurones GABAergic dans le BNST pendant la surveillance des états de sommeil/éveil25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons présenté ici une méthode pour évaluer l’effet de la stimulation optogénétique des neurones avec des identités chimiques particulières sur les transitions d’état du sommeil/éveil et avons donné un exemple de manipulation des neurones DE BNST de GABA. Nos données ont prouvé que l’excitation optogénétique des neurones deBNST de GABA a comme conséquence la transition immédiate du sommeil de NREM à l’éveil.
Diverses conceptions expérimentales son…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été appuyée par le Merck Investigator Studies Program (#54843), un KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas, «WillDynamics» (16H06401) (T.S.), et un KAKENHI Grant-in-Aid for Exploratory Research on Innovative Areas (T.S.) (18H02595).
Materials
| 1×1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1×1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
References
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