चूहे में नींद/
Summary
यहाँ, हम चूहों में नींद / जागना राज्यों की निगरानी के दौरान न्यूरॉन्स के विशेष प्रकार के optogenetic हेरफेर के तरीकों का वर्णन, एक उदाहरण के रूप में stria टर्मिनलिस के बिस्तर नाभिक पर हमारे हाल ही में काम पेश.
Abstract
हाल के वर्षों में, optogenetics व्यापक रूप से neuroवैज्ञानिक अनुसंधान के कई क्षेत्रों में इस्तेमाल किया गया है. कई मामलों में, एक opsin, जैसे चैनल रोडोप्सिन 2 (ChR2), विभिन्न Cre-driver चूहों में न्यूरॉन कोशिकाओं के एक विशेष प्रकार में एक वायरस वेक्टर द्वारा व्यक्त की है. इन opsins के सक्रियण प्रकाश दालों जो लेजर या ऑप्टिक केबल के माध्यम से एलईडी द्वारा वितरित कर रहे हैं के आवेदन से शुरू होता है, और सक्रियण के प्रभाव बहुत उच्च समय संकल्प के साथ मनाया जाता है. प्रयोगकर्ताओं को तीव्रता से न्यूरॉन्स को प्रोत्साहित करते हुए व्यवहार या चूहों में किसी अन्य शारीरिक परिणाम की निगरानी कर रहे हैं. Optogenetics चूहों में नींद के विनियमन में न्यूरॉन सर्किट के समारोह का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी रणनीतियों को सक्षम कर सकते हैं / यहाँ हम चूहों की नींद की अवस्था का मूल्यांकन करने के लिए इलेक्ट्रोएन्सेफेलोग्राम (ईईजी) और इलेक्ट्रोमाइओग्राम (ईएमजी) निगरानी के दौरान एक विशिष्ट रासायनिक पहचान के साथ न्यूरॉन्स के ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर के प्रभाव की जांच करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करते हैं। एक उदाहरण के रूप में, हम stria टर्मिनलिस (BNST) के बिस्तर नाभिक में GABAergic न्यूरॉन्स के हेरफेर का वर्णन. इन न्यूरॉन्स की तीव्र optogenetic उत्तेजना एनआरईएम नींद के दौरान लागू होने पर जागना करने के लिए एक तेजी से संक्रमण से चलाता है। ईईजी/ईएमजी रिकॉर्डिंग के साथ ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर को न्यूरोनल सर्किट को समझने के लिए लागू किया जा सकता है जो नींद/जागरूकता राज्यों को विनियमित करता है।
Introduction
नींद इष्टतम संज्ञानात्मक समारोह के लिए आवश्यक है. हाल के निष्कर्षों से यह भी पता चलता है कि नींद में गड़बड़ी अनेक प्रकार की बीमारियों से जुड़ी हुई है1,2,3. हालांकि नींद के कार्य अभी तक काफी हद तक अनसुलझे हैं, तंत्रिका सर्किट और तंत्रहै कि नियंत्रण नींद को समझने में हाल ही में पर्याप्त प्रगति की गई है / स्तनधारियों में, सतर्कता के तीन राज्य हैं: जागना, गैर-रैपिड आंख आंदोलन (एनआरईएम) नींद, और तेजी से आंख आंदोलन (आरईएम) नींद। जागना उद्देश्यपूर्ण और निरंतर मोटर गतिविधि के साथ कम आयाम के तेजी से ईईजी दोलनों (5-12 हर्ट्ज) की विशेषता है। NREM नींद धीमी दोलनों द्वारा परिभाषित किया गया है (1-4 हर्ट्ज) उच्च आयाम (डेल्टा तरंगों), चेतना और उद्देश्यपूर्ण मोटर गतिविधि की कमी के साथ. रेम नींद कम आयाम के अपेक्षाकृत तेजी से दोलनों (6-12 हर्ट्ज) और लगभग पूरा द्विपक्षीय मांसपेशी atonia5की विशेषता है।
बोर्बेली ने नींद जागना विनियमन के एक सिद्धांत का प्रस्ताव किया जिसे दो प्रक्रिया मॉडल6,7 के रूप में जाना जाताहै। एक homeostatic प्रक्रिया, प्रक्रिया एस के रूप में भी जाना जाता है, नींद का दबाव है कि जागना के दौरान जमा हो जाता है और नींद के दौरान dissipates का प्रतिनिधित्व करता है. एक अन्य प्रक्रिया, जिसे प्रक्रिया सी कहा जाता है, एक सर्कैडियन प्रक्रिया है, जो बताती है कि 24 एच चक्र में सतर्कता स्तर में उतार-चढ़ाव क्यों होता है। इन दो प्रक्रियाओं के अतिरिक्त, नींद के विनियमन केलिए एलोस्टेटिक कारक भी महत्वपूर्ण हैं / Allostatic कारकों पोषण राज्यों और भावना शामिल हैं. भय और चिंता आमतौर पर स्वायत्त और न्यूरोएंडोक्राइन अनुक्रियाओं के साथ कामोत्तेजना में वृद्धि के साथ होती है10,11,12. माना जाता है कि limbic प्रणाली भय और चिंता के विनियमन में एक भूमिका निभाने के लिए माना जाता है, और स्वायत्त और neuroendocrine प्रतिक्रियाओं अंतर्निहित तंत्र बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, लेकिन जिस के द्वारा limbic प्रणाली नींद को प्रभावित करती है / अभी तक पता चला है. ऑप्टो- और फार्माकोजेनेटिक्स का उपयोग करके हाल ही में किए गए अध्ययनों की एक बड़ी संख्या ने सुझाव दिया है कि नींद/जागरण राज्यों को विनियमित करने वाले न्यूरॉन्स और न्यूरोनल सर्किट पूरे मस्तिष्क में वितरित किए जाते हैं, जिसमें कॉर्टिस, बेसल फोरब्रेन, थैलेमस, हाइपोथैलेमस, और मस्तिष्क स्टेम. विशेष रूप से, optogenetics में हाल ही में प्रगति हमें प्रोत्साहित या उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ विशिष्ट तंत्रिका सर्किट मैंn vivo को बाधित करने की अनुमति दी है. इस तकनीक नींद और जागना के तंत्रिका substrates की हमारी समझ में प्रगति की अनुमति देगा, और कैसे नींद / जागना राज्यों circadian प्रक्रियाओं, नींद दबाव, और भावना सहित allostatic कारकों द्वारा विनियमित कर रहे हैं. इस कागज का उद्देश्य कैसे नींद के साथ संयुक्त optogenetic हेरफेर का उपयोग करने के लिए / और जागना. इस तंत्र की समझ जिसके द्वारा लिम्बिक प्रणाली नींद को नियंत्रित करती है / जागना राज्यों स्वास्थ्य के लिए सर्वोपरि महत्व का है, क्योंकि अनिद्रा आमतौर पर चिंता या सोने में असमर्थ होने के डर के साथ जुड़ा हुआ है (सोमनीफोबिया)।
BNST चिंता और भय में एक आवश्यक भूमिका निभाने के लिए सोचा है. जीएडी 67-एक्सप्रेशन गाबार्जिक न्यूरॉन्स BNST12,13की एक प्रमुख आबादी है. हमने नींद / जागना राज्यों पर इन न्यूरॉन्स (गाबाबीएनपीएसटी) के ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर के प्रभाव की जांच की. हाल के वर्षों में तंत्रिका विज्ञान में सबसे बड़ी प्रगति में से एक तरीकों कि विवो में विशेष रासायनिक पहचान के साथ न्यूरॉन्स के हेरफेर सक्षम किया गया है, उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ. Optogenetics तंत्रिका गतिविधि और विशिष्ट व्यवहार प्रतिक्रियाओं14के बीच कारण संबंध का प्रदर्शन करने के लिए अत्यधिक उपयोगी है. हम ऑप्टोजेनेटिक्स को नींद/जागरूकता अवस्थाओं के विनियमन में परिभाषित तंत्रिका परिपथों की कार्यात्मक कनेक्टिविटी की जांच करने के लिए एक विधि के रूप में वर्णन करते हैं। इस तकनीक का उपयोग करके, न्यूरोनल सर्किट को समझने में महान प्रगतिहासिल की गई है जो नींद को विनियमित करता है / . कई मामलों में, opsins विशेष रूप से Cre-driver चूहों और Cre-inducible AAV-मध्यस्थ जीन हस्तांतरण का एक संयोजन द्वारा चयनात्मक मस्तिष्क क्षेत्रों में विशेष रासायनिक पहचान के साथ न्यूरॉन्स में पेश कर रहे हैं. इसके अलावा, इस तरह के channelrhodopsin 2 (ChR2)20 या archaerhodopsin (ArchT)21 एक Cre-loxP या Flp-FRT प्रणाली के साथ संयुक्त के रूप में फोटो के प्रति संवेदनशील opsins के फोकल अभिव्यक्ति हमें एक चयनात्मक न्यूरॉन जनसंख्या और विशिष्ट हेरफेर करने के लिए अनुमति देता है तंत्रिका मार्ग22|
हम यहाँ एक उदाहरण के रूप में BNST में GABAergic न्यूरॉन्स पर प्रयोगों का वर्णन. एक नामित न्यूरॉन आबादी में opsins व्यक्त करने के लिए, उपयुक्त क्रे ड्राइवर चूहों और क्रे-निर्भर वायरस वैक्टर सबसे अक्सर उपयोग किया जाता है. ट्रांसजेनिक या नॉक-इन लाइन्स जिनमें ओपिन्स को विशेष न्यूरोनल आबादी में व्यक्त किया जाता है, वे भी उपयोगी होते हैं। निम्नलिखित प्रयोगों में, हम GAD67-Cre दस्तक में चूहों का इस्तेमाल किया23 जिसमें केवल GABAergic न्यूरॉन्स एक C57BL/6J आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ Cre recombinase व्यक्त करते हैं, और एक AAV वेक्टर जो ChR2 (hChR2 H134R) एक नियंत्रण के रूप में EY या EYFP के साथ जुड़े के साथ एक “FLEx (फ्लिप-निर्णय) स्विच”24| इस प्रक्रिया में विशेष रूप से BNST में GABAergic न्यूरॉन्स के optogenetic उत्तेजना का वर्णन नींद की निगरानी के दौरान /
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहाँ नींद के राज्य संक्रमण पर विशेष रासायनिक पहचान के साथ न्यूरॉन्स के optogenetic उत्तेजना के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत / हमारे डेटा से पता चला है कि गाबाBNST न्यूरॉन्स के optogenetic ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को मर्क अन्वेषक अध्ययन कार्यक्रम (#54843), अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक KAKENHI अनुदान-इन-एड द्वारा समर्थित किया गया था, “WillDynamics” (16H06401) (T.S.), और अभिनव क्षेत्रों पर अन्वेषणात्मक अनुसंधान के लिए एक KAKENHI अनुदान-इन-एड (टी.एस.) (18H02595).
Materials
| 1×1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1×1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
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