Optogenetic manipulasjon av Neural kretser under overvåking søvn/våkenhet States i mus
Summary
Her beskriver vi metoder for optogenetic manipulering av bestemte typer neurons under overvåkning av søvn/våkenhet stater i mus, presentere vårt siste verk på sengen kjernen av stria terminalis som et eksempel.
Abstract
I de senere årene har optogenetics vært mye brukt i mange felt av neuroscientific forskning. I mange tilfeller er en opsin, for eksempel kanal rhodopsin 2 (ChR2), uttrykt ved et virus vektor i en bestemt type neuronal celler i ulike grobunn-driver mus. Aktivering av disse opsins utløses ved anvendelse av lyspulser som leveres med laser eller LED gjennom optiske kabler, og effekten av aktiveringen observeres med svært høy tidsoppløsning. Forskere er i stand til å akutt stimulere neurons mens overvåking atferd eller et annet fysiologisk utfall i mus. Optogenetics kan muliggjøre nyttige strategier for å evaluere funksjon av neuronal kretser i regulering av søvn/våkenhet tilstander i mus. Her beskriver vi en teknikk for å undersøke effekten av optogenetic manipulering av neurons med en bestemt kjemisk identitet under Elektroencefalogram (EEG) og electromyogram (EMG) overvåking for å evaluere søvn fasen av mus. Som et eksempel, beskriver vi manipulering av GABAergic neurons i sengen kjernen av stria terminalis (BNST). Akutt optogenetic eksitasjon av disse neurons utløser en rask overgang til våkenhet når den brukes under REM søvn. Optogenetic manipulasjon sammen med EEG/EMG innspillingen kan brukes til å dechiffrere den neuronal kretser som regulerer søvn/våkenhet stater.
Introduction
Søvn er viktig for optimal kognitiv funksjon. Nylige funn tyder også på at forstyrrelser i søvn er forbundet med et bredt spekter av sykdommer1,2,3. Selv om funksjonene til søvn er hittil i stor grad uløst, har betydelig fremgang blitt gjort nylig for å forstå de nevrale kretser og mekanismer som styrer søvn/våkenhet stater4. I pattedyr, er det tre tilstander av årvåkenhet: våkenhet, ikke-rask øyebevegelse (REM) søvn, og rask øyebevegelse (REM) søvn. Våkenhet er karakterisert ved rask EEG-svingninger (5-12 Hz) av lav amplitude med målrettet og varig motorisk aktivitet. REM søvn er definert av langsom svingninger (1-4 Hz) av høy amplitude (delta bølger), med mangel på bevissthet og målrettet motorisk aktivitet. REM søvn er preget av relativt rask svingninger (6-12 Hz) av lav amplitude og nesten komplett bilateral muskel atonia5.
Borbely foreslo en teori om søvn-våkenhet regulering kjent som de to prosessmodell6,7. En homøostatisk prosess, også referert til som prosess S, representerer søvn trykk som akkumuleres under våkenhet og avleder under søvn. En annen prosess, referert til som prosess C, er en døgn prosess, noe som forklarer hvorfor årvåkenhet nivåer svinger i 24 h syklus. I tillegg til disse to prosessene, allostatic faktorer er også viktig for regulering av Sleep/våkenhet8,9. Allostatic faktorer inkluderer ernæringsmessige tilstander og følelser. Frykt og angst er vanligvis ledsaget av en økning i opphisselse sammen med autonome og Nevroendokrine svar10,11,12. Den limbiske systemet antas å spille en rolle i regulering av frykt og angst, og mekanismer underliggende autonome og Nevroendokrine responser har blitt studert grundig, men veien som limbiske systemet påvirker søvn/våkenhet stater har ikke ennå ikke blitt avslørt. Et stort antall nyere studier med opto-og farmakogenetikk har antydet at neurons og neuronal kretser som regulerer søvn/våkenhet stater er fordelt over hele hjernen, inkludert barken, basal forebrain, thalamus, hypothalamus, og hjernestammen. Spesielt siste fremskritt i optogenetics har tillatt oss å stimulere eller hemme spesifikke nevrale kretser in vivo med høy romlige og timelige oppløsninger. Denne teknikken vil tillate fremgang i vår forståelse av nevrale underlag av søvn og våkenhet, og hvordan søvn/våkenhet stater er regulert av døgn prosesser, søvn trykk, og allostatic faktorer, inkludert følelser. Dette papiret har som mål å innføre hvordan du bruker optogenetic manipulasjon kombinert med søvn/våkne opptak, som kan ha potensial til å oppdatere vår forståelse av connectomes og mekanismer i hjernen som spiller en rolle i regulering av REM søvn, REM søvn, og våkenhet. Forståelse av denne mekanismen som limbiske systemet regulerer sove/våkenhet statene er av overordnet betydning for helsen, fordi søvnløshet er vanligvis forbundet med angst eller frykt for å ikke kunne sove (somniphobia).
Den BNST er antatt å spille en viktig rolle i angst og frykt. Gad 67-uttrykker GABAergic neurons er en stor befolkning på BNST12,13. Vi undersøkte effekten av optogenetic manipulasjon av disse neurons (GABABNST) på søvn/våkenhet stater. En av de største fremskritt i nevrovitenskap de siste årene har vært metoder som muliggjør manipulering av neurons med spesielle kjemiske identiteter in vivo, med høy romlige og timelige oppløsninger. Optogenetics er svært nyttig for å demonstrere årsakssammenheng mellom neural aktivitet og spesifikke atferdsmessige responser14. Vi beskriver optogenetics som en metode for å undersøke funksjonell tilkobling av definerte nevrale kretser i regulering av søvn/våkenhet stater. Ved å benytte denne teknikken, har stor fremgang er oppnådd i forståelsen av neuronal kretser som regulerer søvn/våkenhet statene15,16,17,18,19 . I mange tilfeller er opsins spesielt innført i neurons med bestemte kjemiske identiteter i selektive hjerneområder av en kombinasjon av grobunn-driver mus og grobunn-induserbart AAV-mediert genoverføring. Videre, fokal uttrykk for foto-sensitive opsins som channelrhodopsin 2 (ChR2)20 eller Archaerhodopsin (ArchT)21 kombinert med en grobunn-LOXP eller FLP-frt systemet tillater oss å manipulere en selektiv neuronal befolkning og spesifikke neural Pathway22.
Vi beskriver her eksperimenter på GABAergic neurons i BNST som et eksempel. For å uttrykke opsins i en utpekt neuronal befolkning, passende grobunn driver mus og grobunn-avhengige virus vektorer er mest brukt. Transgene eller knock-in linjer der opsins uttrykkes spesielt neuronal populasjoner er også nyttig. I de følgende forsøkene, brukte vi GAD67-grobunn knock-i mus23 der bare GABAergic neurons Express GROBUNN recombinase med en C57BL/6J genetisk bakgrunn, og en AAV vektor som inneholder ChR2 (hChR2 H134R) smeltet sammen med EYFP eller EYFP som en kontroll med en “FLEx (flip-forbruker) Switch”24. Prosedyren beskriver spesielt optogenetic eksitasjon av GABAergic neurons i BNST under overvåking av søvn/våkenhet stater25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi her presenterte en metode for å evaluere effekten av optogenetic stimulering av neurons med spesielle kjemiske identiteter på statlige overganger av søvn/våkenhet og ga et eksempel på manipulering av GABABNST neurons. Våre data viste at optogenetic eksitasjon av GABABNST neurons resulterer i umiddelbar overgang fra REM søvn til våkenhet.
Ulike eksperimentelle design er tilgjengelig på grunn av utviklingen av mange typer optogenetic verktøy. Det er mulig å ak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av Merck etterforsker Studies Program (#54843), en KAKENHI Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på innovative områder, “WillDynamics” (16H06401) (TS), og en KAKENHI Grant-in-Aid for undersøkende forskning på innovative områder (TS) (18H02595).
Materials
| 1×1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1×1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
References
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?. Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).
- Mellman, T. A. Sleep and anxiety disorders. Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).
- Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).
- Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98 (4), 437-451 (1999).
- Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).
- Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).
- Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).
- Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).
- Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).
- Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).
- Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).
- Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
- Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
- Lin, F., Pichard, J. . Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , (2011).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).
