板基检测血液中一氧化氮的 vasp 磷酸化
Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以解决潜在的使用血小板作为一个高度敏感的一氧化氮传感器在血液中。它描述了最初的血小板制备和使用亚硝酸盐和脱氧红细胞作为一氧化氮发生器。
Abstract
血小板是负责适当血液凝集的血液成分。它们的功能受到各种途径的高度调节。其中最有效的血管活性物质, 一氧化氮 (no), 也可以作为血小板聚集的强大抑制剂。血液中的直接 no 检测是非常具有挑战性的, 因为它具有高反应性与无细胞血红蛋白, 限制 no 的半衰期到毫秒的范围。目前, 干预后的 no 变化仅根据亚硝酸盐和硝酸盐 (亚硝酸盐-一氧化氮代谢途径的成员) 的测量变化进行估计。无论多么精确, 这些测量相对于实际 no 变化的情况很难解释, 因为自然基线亚硝酸盐和硝酸盐水平比 no 本身的预期变化高几个数量级。因此, 早就应该开发直接和简单的方法, 使人们能够直接检测到 no。该协议解决了血小板作为血液中高度敏感的 no 传感器的潜在用途。它描述了最初的血小板富糖血浆 (prp) 和洗血小板制剂, 以及亚硝酸盐和脱氧红细胞作为 no 发生器的使用。采用丝氨酸 239 (p-vaspserine) 法对 vasp 进行磷酸化检测。事实上, vasp 蛋白是高度表达在血小板, 它是快速磷酸化时, no 存在导致一个独特的机会, 使用这一途径直接检测血液中的 no 存在。
Introduction
血小板是从巨核细胞中提取的小圆盘状细胞碎片, 对凝血至关重要。凝血级联是由各种生物活性分子 (如胶原蛋白或 adp), 释放后的血管壁损伤。一氧化氮 (no) 在各种效应之间可以改变凝血过程。no 是由哺乳动物细胞自然产生的, 是最通用的生理信号之一。它作为一个强大的血管扩张剂, 神经递质和免疫调节剂, 仅举几例。在血液中, no 还有助于通过抑制血小板聚集来调节血液凝集的程度。在血液中 no 最可能的来源之一是亚硝酸盐, 这是一种无机离子, 已被证明是 no 的前体。与红细胞反应时, 亚硝酸盐还原为 no, 脱氧 hb 氧化为高铁血红蛋白 (methb)1。从红细胞释放的 no 是血管活性的, 并导致血管兴奋性 2。这种亚硝酸盐还原途径是一种交替的 no 生成途径, 在缺氧条件下, 通过内皮型一氧化氮合酶与经典 no 生成途径一起作用并补充该途径。
血小板本身不能将亚硝酸盐还原为 no, 但对其存在非常敏感。在完整的血小板中, 纳米摩尔范围内的 no 增加了 vasp (ec50 = 0.5 nm) 3 的 cgmp (ec50 = 10 nm)和磷酸化。因此, 血小板可以作为一个很好的传感器, 亚硝酸盐还原由 rbc 和 no 释放到血液中。有几种方法可以直接测量血小板活化的程度-如聚合和血栓弹性成像 (teg)4,5。然而, 这些方法需要昂贵的专门仪器和相当大量的材料。在从 rbc 释放 no 后, 也可以利用血小板表面蛋白表达的变化–如 p-选择素 6–来监测下游的事件.no 也被认为会增加血小板7中的 cgmp 量。以前, 我们使用 cgmp监测脱氧红细胞8还原亚硝酸盐后一氧化氮释放到血液中。这被证明是一个非常敏感的方法;然而, cgmp 是一种短命的分子, 它的检测涉及大量的劳动。另一种可能性, 在提交的协议中描述, 使用磷酸化的血管刺激荧光粉 (vasp)-蛋白检测 no 在血液中的存在。vasp 是蛋白激酶 g 活化的基础, 通过 sgccgmp 途径9与 no 相互作用时进行磷酸化。可检测的 vasp 磷酸化发生在非常低的 no 浓度下, 这可能使血小板成为血液中 no 存在的非常敏感的检测器。vasp 在血小板中表达很高, 但在其他血细胞中没有, 这使得有选择地跟踪涉及血小板10的事件。
该方案的主要目的是通过监测 vasp 磷酸化11,12, 详细描述利用其与血小板的相互作用检测全血一氧化氮释放的方法。该方法允许早期检测低 no 浓度-理论上在纳米摩尔范围内, 这使得目前的协议比 cgmp 的测定更敏感, 因为使用的标准西方印迹技术可以在大多数实验室实现设置。
Protocol
Representative Results
Discussion
由于血小板很容易被激活, 因此需要温和地处理含有血小板的样品。应避免快速移液和剧烈晃动。血小板抑制剂如前列腺素 (pgi2) 可用于防止血小板活化;然而, 这可能会影响血小板内的一些信号通路。在血小板悬浮液中加入 acd, 采用低速离心法制备血小板颗粒。
prp 中新鲜配制的血小板的寿命有限, 最长可达2小时。为了实现高重现性, 所有实验应只在新鲜血小板和血液?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由国家卫生研究院向艾伦·施切特博士提供的校内赠款资助的。
Materials
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2–; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
References
- Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).
- Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
- Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
- Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).
- Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).
- Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).
- Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).
- Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).
- Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
- Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).
- Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
- Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).
