Thrombozyten-basierte Erkennung von Stickoxid im Blut durch die Messung VASP Phosphorylierung
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um die mögliche Verwendung von Thrombozyten als hochsensible Stickoxid-Sensor im Blut zu beheben. Es beschreibt erste Thrombozyten Vorbereitung und die Verwendung von Nitrit und sauerstoffarmes Blut Erythrozyten als Stickoxid-Generatoren.
Abstract
Blutplättchen sind verantwortlich für die ordnungsgemäße Blutgerinnung Blutbestandteilen. Ihre Funktion ist durch verschiedene Wege stark reguliert. Einer der potentesten vasoaktive Agenten, Stickstoffmonoxid (NO), kann auch als eine mächtige Inhibitor der Thrombozytenaggregation handeln. Direkt ist kein Nachweis im Blut sehr anspruchsvoll aufgrund seiner hohen Reaktivität mit zellfreien Hämoglobin, die keine Halbwertszeit bis Millisekundenbereich begrenzt. Derzeit keine Änderungen nach Interventionen nur geschätzt werden anhand der gemessenen Veränderungen von Nitrit und Nitrat (Mitglieder der Stoffwechselweg der Nitrat-Nitrit-NO). Aber genauer gesagt, sind diese Messungen eher schwierig zu interpretieren gegenüber tatsächlichen keine Änderungen aufgrund der natürlich hohe Ausgangswert Nitrit und Nitratgehalte, die mehrere Größenordnungen höher als erwarteten Veränderungen nicht allein sind. Die Entwicklung der direkte und einfache Methoden, die nicht direkt nachweisen lassen würde ist daher längst überfällig. Dieses Protokoll befasst sich einer möglichen Verwendung von Thrombozyten als eine hochsensible kein Sensor im Blut. Es beschreibt erste Thrombozyten rich Plasma (PRP) und gewaschenen Thrombozyten Vorbereitungen und die Verwendung von Nitrit und sauerstoffarmes Blut Erythrozyten als keine Generatoren. Phosphorylierung von VASP an Serin 239 (P-VASPSer239) wird verwendet, um das Vorhandensein von Nr. Die Tatsache, dass VASP Proteins sich besonders in Thrombozyten drückt und dass es schnell phosphoryliert wird, wenn keine vorhanden führt zu eine einmalige Gelegenheit, diesen Weg nutzen, um direkt ohne Präsenz im Blut nachweisen.
Introduction
Thrombozyten sind scheibenförmige kleinzelligen Fragmente aus Megakaryozyten, die entscheidend für die Blutgerinnung sind abgeleitet. Die gerinnende Kaskade wird von verschiedenen bioaktiven Moleküle (wie Kollagen oder ADP), veröffentlicht nach der Verletzung der Gefäßwand initiiert. Die Prozess der Blutgerinnung kann unter verschiedenen Effektoren von Stickstoffmonoxid (NO) geändert werden. Nein, natürlich von Säugerzellen produziert, ist eines der vielseitigsten physiologische Signale. Es wirkt als potenter Vasodilatator, Neurotransmitter und immun-Modulator, einige seiner vielen Funktionen zu nennen. In der Blutbahn hilft auch keine, um das Ausmaß der Blutgerinnung durch Hemmung der Thrombozytenaggregation zu regulieren. Die wahrscheinlichsten Ursachen von NO in den Blutkreislauf zählt Nitrit, eine anorganische Ionen, die gezeigt worden, um als ein Vorläufer der Nr. dienen Reaktion mit roten Blutkörperchen (Erythrozyten), Nitrit reduziert sich auf NO und DeoxyHb ist oxidiert zu Methämoglobin (MetHb)1. Nein von Erythrozyten befreit vasoaktive und verursacht Vasorelaxation2. Dieses Nitrit-Reduktion-Weg ist eine Alternative keine Generation Weg zusammen mit handeln und Ergänzung der klassischen keine Generation Weg durch endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase unter hypoxischen Bedingungen.
Thrombozyten selbst sind nicht in der Lage, Nitrit in NO zu reduzieren, sondern reagieren sehr empfindlich auf ihre Präsenz. In intakten Blutplättchen, nicht in die nanomolaren Reichweite erhöht cGMP (EG50 = 10 nM) und Phosphorylierung von VASP (EG50 = 0,5 nM)3. Thrombozyten können dienen daher als hervorragende Sensor von Nitrit Abbau von Erythrozyten und keine Freisetzung ins Blut. Es gibt mehrere Methoden, die das Ausmaß der Thrombozyten Aktivierung – wie Aggregometry und Thromboelastography (TEG) direkt messen4,5. Diese Methoden erfordern jedoch teuer spezialisierte Instrumentierung und ziemlich große Mengen an Material. Es ist auch möglich, Ereignisse überwachen nachgeschalteten, nach NO wird freigegeben von Erythrozyten, Thrombozyten-Oberfläche Protein-Expression – z. B. P-Selektin6Änderungen bei. Nein ist auch bekannt, die Menge an cGMP in der Thrombozyten-7erhöhen. Früher wir cGMP keine Freisetzung ins Blut nach der Nitrit-Reduzierung durch sauerstoffarmes RBC8zu überwachen. Dies erwies sich als eine sehr empfindliche Methode; Allerdings cGMP ist eine kurzlebige Molekül und seine Entdeckung beinhaltet umfangreiche Arbeit. Eine weitere Möglichkeit, beschrieben in dem vorgestellten Protokoll verwendet Phosphorylierung von gefäßerweiternden stimuliert Phospho (VASP)-Protein, das Vorhandensein von NO im Blut zu erkennen. VASP ist ein Substrat aus Protein Kinase G Aktivierung, die auf die Interaktion mit Nein durch die sGC/cGMP Weg9phosphoryliert wird. Nachweisbare VASP Phosphorylierung tritt bei sehr niedrigen NO-Konzentrationen, die Blutplättchen im Blut einen sehr empfindlichen Detektor keine Präsenz machen könnte. VASP hoch in Thrombozyten angegeben, jedoch nicht in anderen Blutkörperchen, wodurch gezielt die Ereignisse im Zusammenhang mit Thrombozyten10folgen.
Das Hauptziel dieses Protokolls soll die Methode im Detail für den Nachweis von keine Freigabe im Vollblut mit seiner Interaktion mit Thrombozyten durch die Überwachung der VASP Phosphorylierung11,12beschreiben. Das beschriebene Verfahren ermöglicht Früherkennung von niedrigen keine Konzentrationen – theoretisch im nanomolaren Bereich macht dieses Protokolls empfindlicher als cGMP Bestimmung, durch die Verwendung von standard-Western-Blot-Techniken, die in die meisten Labor erreichbare Einstellungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da Thrombozyten leicht aktiviert werden, schonendes Handling von Thrombozyten-haltigen Proben erforderlich ist. Schnellen pipettieren und kräftig schütteln sollte vermieden werden. Thrombozyten-Hemmer wie Prostazyklin (PGI2) können verwendet werden, um Thrombozyten Aktivierung zu verhindern; Dies kann jedoch einige Signalwege innerhalb der Blutplättchen beeinflussen. Für die Vorbereitung von Thrombozyten Pellets wir die Thrombozyten-Suspensionen ACD hinzufügen und langsamem Zentrifugation verwenden.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Intramurale, Dr. Alan N. Schechter NIH finanziert.
Materials
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2–; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
References
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