Rilevazione basata su piastrine di ossido nitrico nel sangue misurando VASP fosforilazione
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per affrontare l’uso potenziale delle piastrine come un sensore molto sensibile dell’ossido di azoto nel sangue. Esso descrive la preparazione iniziale della piastrina e l’uso di nitrito e di cellule rosse del sangue deossigenate come generatori di ossido nitrico.
Abstract
Le piastrine sono le componenti del sangue responsabili della coagulazione sanguigna corretta. Loro funzione altamente è regolata da varie vie. Uno dei più potenti agenti vasoattivi, ossido nitrico (NO), può anche agire come un potente inibitore dell’aggregazione piastrinica. Diretto nessun rilevamento nel sangue è molto impegnativo a causa della sua alta reattività con emoglobina senza cellula che non limita Half-Life per la gamma di millisecondo. Attualmente, nessun cambiamento dopo gli interventi sono solo stimati basato sui cambiamenti misurati di nitriti e nitrati (membri del pathway metabolici di nitrato-nitrito-NO). Tuttavia precisa, queste misure sono piuttosto difficili da non interpretare vis à vis effettivo modifiche, a causa del nitrito naturalmente elevato della linea di base e livelli che sono diversi ordini di grandezza superiori a cambiamenti attesi non sé di nitrati. Di conseguenza, lo sviluppo di metodi diretti e semplici che permetterebbero di individuare direttamente NO è attesa da tempo. Questo protocollo non risolve un potenziale impiego delle piastrine come un altamente sensibili sensore nel sangue. Descrive come nessun generatori di plasma ricco di piastrine iniziale (PRP) e delle piastrine lavate i preparativi e l’uso di nitrito e di cellule rosse del sangue deossigenate. Fosforilazione della VASP a serina 239 (P-VASPSer239) viene utilizzata per rilevare la presenza di NO. Il fatto che la proteina VASP è altamente espressa in piastrine e che esso viene rapidamente fosforilata quando nessuno è presente conduce a un’occasione unica per utilizzare questa via per non rilevare direttamente la presenza nel sangue.
Introduction
Le piastrine sono piccole cellule a forma di disco frammenti derivate dai megacariociti che sono fondamentali per la coagulazione del sangue. La cascata di coagulazione è iniziata da varie molecole bioattive (come collagene o ADP), pubblicati dopo la ferita della parete vascolare. Processo di coagulazione del sangue può essere modificato, tra vari effettori dall’ossido nitrico (NO). NO, prodotta naturalmente dalle cellule di mammiferi, è uno dei più versatili segnali fisiologici. Esso agisce come un potente vasodilatatore, neurotrasmettitore e modulatore immunitario, per citarne alcune delle sue numerose funzioni. Nel sangue, NO anche aiuta a regolare l’entità della coagulazione del sangue inibendo l’aggregazione della piastrina. Una delle fonti più probabile di NO nel sangue è nitrito, un ione inorganico che ha dimostrato di servire come un precursore del No. Reagendo con globuli rossi (RBCs), nitrito è ridotto a n e deoxyHb è ossidato a metaemoglobina (metHb)1. NO rilasciato da globuli rossi è vasoattivi e provoca vasodilatazione2. Questo percorso di riduzione di nitriti non è un supplente nessun percorso di generazione, agire insieme con e non integrare la classica nessun percorso di generazione mediante endoteliale di ossido nitrico sintasi in condizioni di ipossia.
Le piastrine se stessi non sono in grado di ridurre il nitrito in NO ma sono molto sensibili alla sua presenza. In piastrine intatte, non nel nanomolari gamma aumenta cGMP (CE50 = 10 nM) e fosforilazione della VASP (CE50 = 0.5 nM)3. Di conseguenza, le piastrine possono servire come un ottimo sensore di riduzione di nitrito di RBCs e nessun rilascio nel sangue. Ci sono diversi metodi che possono misurare direttamente il grado di attivazione piastrinica – come aggregometria e tromboelastografia (TEG)4,5. Tuttavia, questi metodi richiedono strumentazione specializzata costosi e piuttosto grandi quantità di materiale. È inoltre possibile monitorare gli eventi a valle, dopo NO viene rilasciato da globuli rossi, utilizzando i cambiamenti nell’espressione di proteina di superficie delle piastrine – ad esempio P-selectin6. NON è noto anche per aumentare la quantità di cGMP in piastrine7. In precedenza, abbiamo usato cGMP per non controllare nessun rilascio nel sangue dopo la riduzione del nitrito di deossigenata RBC8. Ciò rivelata per essere un metodo molto sensibile; Tuttavia, cGMP è una molecola di breve durata e la relativa rilevazione coinvolge vasto lavoro. Un’altra possibilità, descritta nel protocollo presentato, utilizza la fosforilazione del phospho vasodilatatore-stimolata (VASP)-proteina per rilevare la presenza di NO nel sangue. VASP è un substrato di attivazione della proteina chinasi G, che è fosforilata sull’interazione con NO attraverso la via sGC/cGMP9. Fosforilazione VASP rilevabile si verifica molto basso senza concentrazioni, che potrebbero rendere le piastrine un rivelatore molto sensibile di nessuna presenza nel sangue. VASP è altamente espresso in piastrine, ma non in altre cellule del sangue, che permette di seguire in modo selettivo gli eventi che coinvolgono le piastrine10.
L’obiettivo principale del presente protocollo è di descrivere il metodo in dettaglio per la rilevazione di nessun rilascio nel sangue intero utilizzando la sua interazione con le piastrine monitorando VASP fosforilazione11,12. Il metodo descritto non consente di individuazione tempestiva di basso vi erano concentrazioni – teoricamente in gamma nanomolar che rende più sensibile di determinazione di cGMP, dovute all’uso di tecniche standard Western blot realizzabili in laboratorio la maggior parte del presente protocollo Impostazioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Poiché le piastrine sono attivate, un trattamento delicato del piastrina-contenenti campioni è richiesto. Pipettaggio veloce e vigorosa agitazione dovrebbe essere evitati. Inibitori delle piastrine come prostaciclina (PGI2) possono essere utilizzati per impedire l’attivazione della piastrina; Tuttavia, questo potrebbe influire sulla alcune vie di segnalazione all’interno delle piastrine. Per la preparazione di pellet della piastrina, aggiungiamo ACD per le sospensioni della piastrina e utilizzare centrifugaz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione intramurale NIH Dr Alan N. Schechter.
Materials
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2–; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
References
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