Nitrik oksit VASP fosforilasyon ölçme tarafından kan trombosit tabanlı algılama
Summary
Burada, trombosit potansiyelini kullanmak son derece hassas nitrik oksit sensör kan olarak adrese bir iletişim kuralı mevcut. Nitrik oksit jeneratörler ilk trombosit hazırlık ve nitrit ve deoxygenated kırmızı kan hücreleri kullanımını açıklar.
Abstract
Trombosit kan bileşenleri uygun kan pıhtılaşması için sorumlu vardır. Onların işlevi son derece çeşitli yolları tarafından düzenlenir. En güçlü vazoaktif ajanlar, nitrik oksit (NO), biri de trombosit toplama güçlü bir inhibitörü olarak hareket edebilir. Doğrudan hiçbir algılama kan yok half-life milisaniyelik aralığı için sınırlar boş hücre hemoglobin ile onun yüksek reaktivite nedeniyle çok zor olduğunu. Şu anda, müdahaleler sadece tahmin edilir sonra herhangi bir değişiklik, nitrit ve nitrat (nitrat-nitrit-Hayır metabolik yolu üyeleri) ölçülen değişiklikleri dayalı. Ancak kesin, bu ölçümler vis bir vis gerçek doğal olarak yüksek temel nitrit nedeniyle herhangi bir değişiklik yorumlamak ve büyüklükte birkaç emir hiçbir kendisinin beklenen değişiklikler yüksek düzeylere nitrat oldukça zordur. Bu nedenle, bir Hayır doğrudan algılamak olanak sağlayacak doğrudan ve basit yöntem geliştirme gecikmiş olduğunu. Bu iletişim kuralı hiçbir sensör kan trombosit olarak son derece hassas bir potansiyel kullanımı giderir. HİÇBİR jeneratörler ilk trombosit zengin plazma (PRP) ve yıkanmış trombosit preparatları ve nitrit ve deoxygenated kırmızı kan hücreleri kullanımını açıklar. VASP fosforilasyon, serin 239 (P-VASPSer239) No var olup olmadığını belirlemek için kullanılır VASP protein yüksek trombosit ifade edilir ve bu hızla oluşturulduğunda fosforile da mevcuttur aslında doğrudan kan içinde yok olup olmadığını belirlemek için bu yolu kullanmak için eşsiz bir fırsat yol açar.
Introduction
Trombosit kan pıhtılaşması için çok önemli megakaryocytes türetilen küçük hücreli disk şeklindeki oluşuyor. Pıhtılaşma cascade vasküler duvar yaralanma sonra yayımlanan çeşitli biyoaktif molekülleri (örneğin, kollajen veya ADP) tarafından başlatılır. Kan pıhtılaşma işlemi, nitrik oksit (NO) tarafından çeşitli effectors arasında değiştirilebilir. Hayır, doğal memeli hücreleri tarafından üretilen, çok yönlü fizyolojik sinyalleri biridir. Bir güçlü vazodilatör, nörotransmitter ve birçok işlevleri bir kaç isim için bağışıklık modülatör olarak davranır. Kan dolaşımında, Hayır da pıhtılaşması kan trombosit toplama engelleyerek ölçüde düzenleyecek yardımcı olur. No kan olasılıkla kaynaklarından biridir nitrit, No bir habercisi hizmet etmek için gösterilen bir inorganik iyon Kırmızı kan hücreleri (RBCs) ile tepki, nitrit Hayır olarak azalır ve deoxyHb methemoglobin (metHb)1‘ e okside. Hayır RBCs yayımlanan vazoaktif ve vasorelaxation2neden olur. Bu nitrit azaltma yolu bir başka hiçbir üretimi, ile birlikte hareket eden ve klasik üretimi yol hipoksik koşulları, endotelyal nitrik oksit sentaz tarafından tamamlayan yoludur.
Trombosit kendilerini nitrit NO azaltmak mümkün değildir ama onun hazır bulunma için çok hassas. Sağlam trombosit içinde nanomolar içinde Hayır cGMP aralığını artırır (EC50 = 10 nM) ve fosforilasyon VASP (EC50 0,5 = nM)3. Bu nedenle, trombosit mükemmel bir sensör nitrit azaltma RBCs ve hiçbir yayın kana olarak sunabilir. Trombosit aktivasyon – aggregometry ve Tromboelastografi (TEG) gibi ölçüde doğrudan ölçebilirsiniz birkaç yöntem vardır4,5. Ancak, bu yöntem pahalı özel araçları ve malzeme oldukça büyük miktarda gerektirir. Aynı zamanda mümkün olan olayları izlemek aşağı akım, Hayır sonra RBCs, platelet yüzey protein ifadesindeki –6P-selektin gibi değişiklikleri kullanarak üzerinden serbest bırakılır. Hayır da trombosit7cGMP miktarını artırmak için bilinir. Daha önce biz hiçbir yayın içine kan deoxygenated RBC8tarafından nitrit azaltma sonra izlemek için cGMP kullanılır. Bu çok hassas bir yöntem olduğunu kanıtladı; Ancak, cGMP kısa ömürlü bir moleküldür ve geniş iş onun algılama içerir. Başka bir olasılık, sunulan protokolünde açıklanan vazodilatör uyarılmış Fosfo (VASP) fosforilasyon kullanır-Hayır kan içinde var olup olmadığını belirlemek için protein. VASP bir substrat-sGC/cGMP yolu9NO ile etkileşim üzerine fosforile protein kinaz G etkinleştirme var. Algılanabilir VASP fosforilasyon oluşur çok düşük Hayır konsantrasyonları, trombosit kanda herhangi bir varlığı çok hassas bir dedektör yapabiliriz. VASP yüksek trombosit ifade edilir, ancak diğer kan hücreleri seçerek trombosit10içeren olayları takip etmek sağlayan değil.
Bu iletişim kuralının temel amacı ayrıntılı yöntemi tam kan trombosit ile etkileşimi VASP fosforilasyon11,12izleyerek kullanarak hiçbir sürümde tespiti için tarif etmektir. Açıklanan yöntemi düşük erken teşhis yok konsantrasyonları – teorik olarak mevcut iletişim kuralı standart Western blot ulaşılabilir teknikleri çoğu laboratuvar kullanımı nedeniyle cGMP belirlenmesi daha duyarlı kılan nanomolar aralığında sağlar Ayarlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trombosit kolayca etkinleştirilir beri trombosit içeren işlenmesi nazik örnekleri gereklidir. Hızlı pipetting ve güçlü sallayarak kaçınılmalıdır. Trombosit inhibitörleri gibi prostacyclin (PGI2) trombosit aktivasyon önlemek için kullanılabilir; Ancak, bu bazı sinyal yolları içinde trombosit etkileyebilir. Trombosit granül kursları, ACD trombosit süspansiyonlar ekleyebilir ve düşük hızlı Santrifüjü kullanabilirsiniz.
Taze hazırlanmış trombositlerin P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIH intramural hibe Dr Alan N. Schechter tarafından finanse edildi.
Materials
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2–; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
References
- Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).
- Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
- Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
- Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).
- Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).
- Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).
- Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).
- Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).
- Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
- Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).
- Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
- Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).
