זיהוי מבוסס על טסית דם של תחמוצת החנקן בדם על ידי מדידת זרחון VASP
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לטפל להשתמש הפוטנציאל של טסיות דם כמו חיישן רגיש מאוד תחמוצת החנקן בדם. זה מתאר טסיות הראשונית הכנה ושימוש חנקיתי ו רווית תאי דם אדומים גנרטורים תחמוצת החנקן.
Abstract
הטסיות הן רכיבי הדם אחראי על קרישת הדם תקין. תפקידם הוא מאוד מווסתות על ידי מסלולים שונים. אחד הסוכנים vasoactive הקטלניים ביותר, תחמוצת החנקן (NO), יכול גם לפעול מעכב חזק של הצטברות של טסיות דם. ישיר אין זיהוי בדם הוא מאוד מאתגר עקב שלה תגובתיות גבוהה עם המוגלובין ללא תא המגביל מחצית אין חיים על הטווח אלפיות השנייה. כיום, אין שינויים לאחר התערבויות מוערכות רק בהתבסס על שינויים מדודה של חנקיתי חנקתי (חברים של מסלול מטבולי חנקת-חנקיתי-לא). עם זאת מדויק, מדידות אלה הם די קשה לפרש מול בפועל ללא שינויים, עקב חנקיתי בסיסית גבוהה באופן טבעי טונות רמות שנמצאים במספר סדרי גודל גבוה יותר מאשר שינויים צפויים לא עצמו. לכן, בפיתוח שיטות ישירה ופשוטה שתאפשר אחד לזהות לא ישירות הוא מזמן. פרוטוקול זה מטפל שימוש פוטנציאלי של טסיות כמו רגישות גבוהה לא חיישן בדם. זה מתאר פלזמה עשיר טסיות הראשונית (PRP) ואת ההכנות טסיות שטף את השימוש חנקיתי רווית תאי דם אדומים גנרטורים אין. זירחון של VASP-סרין 239 (P-VASPSer239) משמש כדי לזהות הנוכחות של מס העובדה כי חלבון VASP מתבטאת מאוד טסיות הדם, כי זה הוא במהירות phosphorylated כאשר לא קיים מוביל הזדמנות ייחודית לשימוש מסלול זה ישירות לאתר בו שום נוכחות בדם.
Introduction
הטסיות הן שברי תאים קטנים בצורת דיסק נגזר megakaryocytes כי הם חיוניים קרישת הדם. המפל קרישת דם הוא שיזם מולקולות ביו שונים (כגון קולגן או ADP), שוחרר לאחר פציעתו של קיר כלי הדם. תהליך קרישת הדם יכול להיות שונה, בין effectors השונים על ידי תחמוצת החנקן (NO). . לא, באופן טבעי המיוצר על ידי תאי יונקים, הוא אחד המגוונים ביותר אותות פיזיולוגיים. היא פועלת vasodilator חזק, מוליך עצבי, אפנן המערכת החיסונית, שם כמה הפונקציות הרבות שלה. בכלי הדם, לא גם מסייע לווסת את היקף קרישת הדם על ידי עיכוב הצטברות של טסיות דם. אחד המקורות סביר ביותר לא במחזור הדם הוא חנקיתי, יון אנאורגניים זה הוכח להוות סימן מקדים של מס מגיבה עם כדוריות דם אדומות (RBCs) חנקיתי מופחתת ללא, deoxyHb תחמוצת methemoglobin (metHb)1. לא שוחררו RBCs הוא vasoactive וגורם vasorelaxation2. מסלול זה הפחתת חנקיתי הוא תוכנית חלופית אין מסלול הדור, מתנהג יחד עם ו משלימים קלאסית אין שביל דור על ידי סינתאז תחמוצת החנקן אנדותל-תנאים ובשפתיים.
טסיות הדם עצמם אינם מסוגלים להפחית חנקיתי לתוך לא אבל רגישים מאוד את נוכחותה. בטסיות תקין, לא ב- nanomolar טווח מגדילה cGMP (EC50 = 10 ננומטר), זירחון של VASP (EC50 = 0.5 ננומטר)3. לכן, טסיות עשויים לשמש חיישן מעולה של הפחתת חנקיתי RBCs, אין שחרור לדם. ישנן מספר שיטות שבהן באפשרותך למדוד ישירות את היקף ההפעלה טסיות – כגון aggregometry ו- thromboelastography (TEG)4,5. עם זאת, שיטות אלה דורשים יקר במכשור מיוחד, כמויות די גדולות של חומר. זה גם אפשרי לעקוב אחר אירועים במורד הזרם, לאחר לא הוא שוחרר מן RBCs, באמצעות השינויים בביטוי חלבונים משטח טסיות – כגון בחירת שמלות P6. לא ידוע גם להגדיל את כמות cGMP ב טסיות הדם7. בעבר, היינו cGMP לפקח אין שחרור לתוך הדם לאחר הפחתה חנקיתי מאת RBC רווית8. זה הוכיח להיות שיטה מאוד רגיש; עם זאת, cGMP הוא מולקולה קצרת ימים, זיהוי שלו כרוכה עבודה נרחב. אפשרות נוספת, שמתואר פרוטוקול שהוצגו, משתמשת זירחון של פוספו מגורה מרחיב כלי דם (VASP)-חלבון כדי לזהות הנוכחות של NO בדם. VASP הוא מצע של הפעלת קינאז גרם חלבון, אשר הוא phosphorylated על האינטראקציה עם לא דרך הסטארגייט/cGMP מסלול9. זרחון VASP לזיהוי מתרחשת ללא נמוך מאוד ריכוזי, שעלולה לגרום טסיות גלאי רגיש מאוד אין נוכחות בדם. VASP מתבטאת מאוד טסיות, אך לא בתאים אחרים בדם, מה שמאפשר לעקוב באופן סלקטיבי את האירועים הקשורים טסיות10.
המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לתאר את שיטת בפירוט עבור זיהוי אין שחרור בדם כל שימוש ביחסיו עם טסיות דם על-ידי ניטור VASP זרחון11,12. השיטה המתוארת מאפשרת גילוי מוקדם של נמוך אין ריכוזים – תיאורטית בטווח nanomolar מה שהופך את הפרוטוקול הנוכחי רגיש יותר נחישות cGMP, עקב השימוש של טכניקות תספיג סטנדרטי השגה במעבדה רוב הגדרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאז טסיות מופעלים בקלות, עדין טיפול של טסית דם המכילים דוגמאות נדרש. יש להימנע pipetting מהר, ומנענע נמרצת. מעכבי טסיות כגון prostacyclin (PGI2) יכול לשמש כדי למנוע הפעלה טסית דם; עם זאת, זה עלול להשפיע על איזה איתות המסלולים בתוך טסיות הדם. עבור הכנת כדורי טסיות, אנו להוסיף ACD המתלים טסיות ולהשתמש נ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן על ידי מענק מגזר NIH ד ר אלן ש שכטר.
Materials
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2–; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
References
- Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).
- Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
- Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
- Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).
- Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).
- Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).
- Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).
- Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).
- Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
- Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).
- Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
- Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).
