Bloedplaatjes gebaseerde detectie van stikstofmonoxide in bloed door het meten van VASP fosforylatie
Summary
Hier presenteren we een protocol om het potentiële gebruik van bloedplaatjes als een hooggevoelige stikstofmonoxide sensor in bloed. Het beschrijft eerste bloedplaatjes voorbereiding en het gebruik van nitriet en gedeoxygeneerd rode bloedcellen als stikstofmonoxide generatoren.
Abstract
Bloedplaatjes zijn de bloedbestanddelen die verantwoordelijk zijn voor een goede bloedstolling. Hun functie is sterk gereguleerd door verschillende trajecten. Een van de meest potente vasoactieve agenten, stikstofmonoxide (NO), kan ook fungeren als een krachtige remmer van aggregatie van de bloedplaatjes. Direct is geen detectie in bloed zeer uitdagend vanwege haar hoge reactiviteit met cel-vrij hemoglobine geen half-life naar de milliseconde bereik te beperken. Op dit moment geen wijzigingen na interventies zijn slechts geraamd op basis van gemeten wijzigingen nitriet en nitraat (leden van de nitraat-nitriet-NO metabolische weg). Echter precieze, deze metingen zijn lastig te interpreteren vis een vis werkelijke geen veranderingen, als gevolg van de natuurlijk hoge basislijn nitriet en nitraat niveaus die verschillende ordes van grootte hoger dan verwachte wijzigingen van geen zelf. Daarom is de ontwikkeling van directe en eenvoudige methoden die het mogelijk een maken te detecteren NO direct allang. Dit protocol adressen een potentiële gebruik van bloedplaatjes als een hooggevoelige geen sensor in bloed. Het beschrijft eerste platelet rich plasma (PRP) en gewassen bloedplaatjes preparaten en het gebruik van nitriet en gedeoxygeneerd rode bloedcellen als geen generatoren. Fosforylering van VASP op serine 239 (P-VASPSer239) wordt gebruikt voor het detecteren van de aanwezigheid van nr. Het feit dat VASP eiwit sterk in bloedplaatjes uitgedrukt wordt en dat het snel is phosphorylated als er geen aanwezig leidt tot een unieke kans om dit traject kunt direct geen aanwezigheid in het bloed.
Introduction
Bloedplaatjes zijn kleine schijf-vormige cel fragmenten afgeleid van megakaryocytes, die cruciaal zijn voor de bloedstolling. De bloedstolling cascade wordt geïnitieerd door verschillende biologische actieve moleculen (zoals collageen of ADP), vrijgegeven na de verwonding van vasculaire muur. Het bloed bloedstolling proces kan worden gewijzigd, onder verschillende effectoren door stikstofmonoxide (NO). Nee, natuurlijk geproduceerd door cellen van zoogdieren, is een van de meest veelzijdige fysiologische signalen. Het fungeert als een krachtige vaatverwijdende, neurotransmitter en immune modulator, een paar van de vele functies te noemen. In de bloedbaan, helpt niet ook om het reguleren van de omvang van de bloedstolling door remming van de aggregatie van de bloedplaatjes. Een van de meest waarschijnlijke bronnen voor NO in de bloedbaan is nitriet, een anorganische ion dat is getoond om te dienen als een voorloper van nr. Reactie met rode bloedcellen (RBC), nitriet wordt verminderd op Nee en deoxyHb is geoxideerd tot methemoglobine (metHb)1. NO verlost van RBC is vasoactieve en veroorzaakt vasorelaxation2. Dit nitriet vermindering traject is een alternatief geen generatie traject, optreden samen met en als aanvulling op de klassieke geen generatie pad door endothelial stikstofoxide synthase bij hypoxische voorwaarden.
Bloedplaatjes zelf zijn niet kundig voor nitriet in NO verminderen maar zijn zeer gevoelig voor haar aanwezigheid. In intact Trombocyten, niet in de nanomolar bereik vergroot cGMP (EG50 = 10 nM) en fosforylering van VASP (EG50 = 0,5 nM)3. Daarom, bloedplaatjes kunnen dienen als een uitstekende sensor van nitriet reductie tegen RBC en geen introductie in bloed. Er zijn verschillende methoden die direct van de omvang van de activatie van de bloedplaatjes – zoals aggregometry en thromboelastography (TEG meten kunnen)4,5. Echter, deze methoden vereisen dure gespecialiseerde instrumentatie en vrij grote hoeveelheden materiaal. Het is ook mogelijk om gebeurtenissen te controleren downstream, na Nee wordt vrijgelaten uit de RBC, met behulp van de wijzigingen in bloedplaatjes oppervlakte-proteïne expressie – zoals de P-selectine6. Nee is ook bekend om de hoeveelheid cGMP in de bloedplaatjes7te verhogen. Wij vroeger cGMP geen introductie in bloed te controleren na de nitriet verkleining door gedeoxygeneerd RBC8. Dit bleek een zeer gevoelige methode; echter cGMP is een kortstondige molecule en de detectie omvat uitgebreide arbeid. Een andere mogelijkheid, zoals beschreven in het voorgestelde protocol, maakt gebruik van fosforylering van de phospho van vaatverwijdende-gestimuleerd (VASP)-eiwit op de aanwezigheid van NO in het bloed. VASP is een substraat van proteïne kinase G activering, die op de interactie met NO t/m de sGC/cGMP traject9is phosphorylated. Detecteerbare VASP fosforylatie treedt op bij zeer lage NO concentraties, ertoe dat bloedplaatjes een zeer gevoelige detector van geen aanwezigheid in het bloed leiden kunnen. VASP is sterk uitgedrukt in bloedplaatjes, maar niet in andere cellen van het bloed, waardoor de gebeurtenissen waarbij bloedplaatjes10selectief te volgen.
Het hoofddoel van dit protocol is te beschrijven de methode gedetailleerd voor de detectie van geen vrijgave in volbloed zijn interactie met bloedplaatjes via toezicht VASP fosforylatie11,12. De beschreven methode maakt de vroege ontdekking van lage geen concentraties – theoretisch in het bereik van nanomolar, waardoor dit protocol gevoeliger dan cGMP bepaling, als gevolg van het gebruik van standaard westelijke vlek technieken haalbaar in meeste laboratorium Instellingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aangezien de bloedplaatjes zijn gemakkelijk geactiveerd, zachte behandeling van bloedplaatjes-bevattende monsters is vereist. Snelle pipetteren en krachtig schudden moet worden vermeden. Bloedplaatjes remmers zoals prostacyclin (“BGA”2) kunnen worden gebruikt om te voorkomen dat bloedplaatjes activering; Nochtans, kan dit sommige signaalroutes binnen de bloedplaatjes beïnvloeden. Voor de bereiding van bloedplaatjes pellets, we ACD toevoegen aan de bloedplaatjes schorsingen en gebruiken van lage snelheid centr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de NIH intramurale subsidie aan Dr. Alan N. Schechter.
Materials
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2–; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
References
- Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).
- Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
- Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
- Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).
- Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).
- Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).
- Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).
- Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).
- Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
- Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).
- Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
- Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).
