Trombocyt-baserad detektion av kväveoxid i blodet genom att mäta VASP fosforylering
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att åtgärda den potentiella användningen av trombocyter som en mycket känslig kväveoxid sensor i blod. Det beskriver inledande trombocytantal förberedelse och användning av nitrit och syrefattigt röda blodkroppar som kväveoxid generatorer.
Abstract
Trombocyter är ansvarig för korrekt blodkoagulation blodkomponenter. Deras funktion är hårt reglerad av olika vägar. En av de mest potenta vasoaktiva ämnen, kväveoxid (NO), kan också fungera som en kraftfull hämmare av trombocytaggregationen. Direkt är ingen upptäckt i blod mycket utmanande på grund av dess höga reaktivitet med cell-fritt hemoglobin som begränsar ingen halveringstid att millisekunden spänna. För närvarande utifrån inga ändringar efter insatser beräknas endast uppmätta förändringar av nitrit och nitrat (medlemmar i nitrat-nitrit-NO metabolism). Men exakt, dessa mätningar är ganska svårt att tolka gentemot faktiska utan ändringar, på grund av den naturligt höga baslinjen nitrit och nitrat i nivåer som är flera tiopotenser högre än förväntade förändringar av inga själv. Därför är utvecklingen av direkt och enkla metoder som gör det möjligt för en att upptäcka nr direkt efterlängtad. Detta protokoll adresser en potentiell användning av blodplättar som en mycket känslig ingen sensor i blod. Det beskriver inledande trombocytantal rika plasma (PRP) och tvättade trombocytantal preparat och användningen av nitrit och syrefattigt röda blodkroppar som ingen generatorer. Fosforylering av VASP på Serin 239 (P-VASPSer239) används för att upptäcka förekomsten av NO. Det faktum att VASP proteinet uttrycks mycket i trombocyter och att det snabbt är fosforyleras då ingen är närvarande leder till en unik möjlighet att använda denna väg att direkt detektera ingen närvaro i blodet.
Introduction
Trombocyter är små skivformiga cellen fragment härrör från megakaryocyter som är viktiga för blodets koagulering. Koagulering kaskad initieras av olika bioaktiva molekyler (såsom kollagen eller ADP), släppt efter skadan av kärlväggen. Blod koagulering process kan ändras, bland olika effektorer av kväveoxid (NO). Nej, produceras naturligt av däggdjursceller, är en av de mest mångsidiga fysiologiska signalerna. Det fungerar som en potent vasodilator, signalsubstans och immunmodulator, för att nämna några av dess många funktioner. I blodet, inget också hjälper till att reglera omfattningen av blodproppar genom att hämma trombocytaggregationen. En av de mest sannolika källorna för NO i blodomloppet är nitrit, en oorganisk Jon som har visat sig fungera som en föregångare av NO. Reagera med röda blodkroppar (RBC), nitrit reduceras till NO och deoxyHb oxideras till methemoglobin (metHb)1. NR släppt från röda blodkroppar är vasoaktiva och orsakar vasorelaxation2. Denna nitrit minskning väg är en suppleant ingen generation väg, agerar tillsammans med och kompletterar den klassiska ingen generation sökväg av endothelial kväveoxid syntas på hypoxisk villkor.
Trombocyter själva är inte kunna reducera nitrit till NO men är mycket känsliga för sin närvaro. I intakt trombocyter, inte i nanomolar utbudet ökar cGMP (EG50 = 10 nM) och fosforylering av VASP (EG50 = 0,5 nM)3. Trombocyter kan därför tjäna som ett utmärkt sensor av nitrit minskning av röda blodkroppar och ingen utsättning i blod. Det finns flera metoder som direkt kan mäta omfattningen av trombocytaktivering – såsom aggregometry och thromboelastography (TEG)4,5. Dessa metoder kräver dock dyra specialiserade instrumentering och ganska stora mängder material. Det är också möjligt att övervaka händelser nedströms, efter NO frisätts från RBC, använda ändringarna i trombocytantal ytan proteinuttryck – till exempel P-selektin6. Nej är också känt att öka mängden av cGMP i trombocyter7. Tidigare använde vi cGMP att övervaka något utsläpp i blodet efter nitrit reduktion av syrefattigt RBC8. Detta visade sig vara en mycket känslig metod; cGMP är en kortlivad molekyl dock och dess upptäckt handlar om omfattande arbete. En annan möjlighet, beskrivs i protokollet presenteras, använder fosforylering av de vasodilaterande-stimulerad phospho (VASP)-protein för att upptäcka förekomsten av NO i blod. VASP är ett substrat av protein kinase G aktiveringen, som är fosforyleras vid samspelet med nr via sGC/cGMP vägen9. Detekterbara VASP fosforylering inträffar vid mycket låg nr koncentrationer, som kunde göra blodplättar en mycket känslig detektor av ingen närvaro i blodet. VASP uttrycks mycket i trombocyter, men inte i andra blodkroppar, vilket gör för att följa selektivt de händelser som involverar trombocyter10.
Det huvudsakliga målet med detta protokoll är att beskriva metoden i detalj för detektion av inga utsläpp i helblod med dess interaktion med trombocyter genom övervakning VASP fosforylering11,12. Den beskrivna metoden möjliggör tidig upptäckt av låg ingen koncentrationer – teoretiskt i intervallet nanomolar vilket gör protokolls känsligare än cGMP beslutsamhet, på grund av användning av standard Western blot teknik kan uppnås i de flesta laboratorium inställningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eftersom trombocyter aktiveras lätt, skonsam hantering av trombocyt-innehållande prover krävs. Snabb pipettering och kraftig skakning bör undvikas. Trombocythämmare såsom prostacyklin (SGB2) kan användas för att förhindra trombocytaktivering; Detta kan emellertid påverka vissa signalvägar inuti blodplättarna. För beredning av trombocyter pellets, vi lägger till ACD trombocytantal upphängningarna och använder lågt varvtal centrifugering.
Nylagade trombocyter i PRP ha…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av NIH intramurala bidrag till Dr Alan N. Schechter.
Materials
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2–; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
References
- Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).
- Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
- Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
- Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).
- Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).
- Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).
- Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).
- Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).
- Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
- Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).
- Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
- Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).
