علم الطاقة الحيوية التحقيق المبيضات البيض "باستخدام" الوقت الحقيقي خارج الخلية التمويه التحليل
Summary
هنا، نقدم بروتوكول التدرجي للتحقيق في التنفس المتقدرية والدالة جليكوليتيك في المبيضات البيض استخدام محلل تدفق إضافي.
Abstract
الميتوكوندريا هي العضيات الضرورية الأيض الخلوية والبقاء على قيد الحياة. مجموعة متنوعة من الأحداث الرئيسية تجري في الميتوكوندريا، مثل التنفس الخلوي والتمثيل الغذائي الأكسدة وتوصيل الإشارة والمبرمج. ونتيجة لذلك، أفيد بخلل mitochondrial تلعب دوراً هاما في التسامح العقاقير المضادة للفطور وضراوة من الفطريات المسببة للأمراض. البيانات الأخيرة أدت أيضا إلى الاعتراف بأهمية الميتوكوندريا بوصفها مساهما هاما في الآلية المرضية الفطرية. وعلى الرغم من أهمية الميتوكوندريا في الأحياء الفطرية، هي بدائية أساليب موحدة لفهم وظيفتها. نقدم هنا، إجراء دراسة معدل استهلاك الأكسجين القاعدية (OCR)، مقياسا للتنفس المتقدرية، ومعدلات تحمض خارج الخلية (عكر)، مقياسا للدالة جليكوليتيك في سلالات المبيضة . يمكن تطبيق الطريقة الموضحة هنا لأي ضغوط كانديداسب. دون الحاجة إلى تنقية الميتوكوندريا من الخلايا الفطرية سليمة. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تخصيص هذا البروتوكول إلى الشاشة لمثبطات للوظيفة المتقدرية في سلالات المبيضة .
Introduction
الأمراض الفطرية الغازية تقتل ما يزيد على 1.5 مليون شخص سنوياً في جميع أنحاء العالم. هذا الرقم في الارتفاع بسبب زيادة في عدد الأشخاص الذين يعيشون مع حصانة المساس بها، بما في ذلك الرضع المسنين، سابق لأوانه، ومتلقي زرع، و مرضى السرطان1. المبيضة هو ممرض فطرية بشرية انتهازية التي جزء من النبت البشرية. كما يقطن الأسطح المخاطية والجهاز الهضمي ككائن كومينسال. وتنتج المبيضة الأمراض الجهازية الخطيرة في الأشخاص الذين لديهم أوجه القصور المناعي، الذين خضعوا لعملية جراحية، أو الذين قد تم التعامل مع دورات طويلة من المضادات الحيوية. أنواع المبيضات الرتبة من بين أعلى ثلاثة إلى أربعة أسباب الأمراض المعدية (NID) المستشفيات في البشر2،3،،من45،،من67. ويقدر عدد العالمية السنوية من التهابات مجرى الدم المبيضات حالات ~ 400,000، مع نفوق المرتبطة بها من 46-75%1. الوفيات السنوية بسبب داء المبيضات هو تقريبا 10000 في الولايات المتحدة وحدها. مدى NID تسببها الفطريات ينعكس أيضا في نفقات المريض الفلكية5. في الولايات المتحدة، تفوق النفقات السنوية لعلاج الأمراض الفطرية الغازية $ 2 بیلیون، مضيفاً سلالة ضخمة لنظام الرعاية الصحية المثقلة بالفعل. العلاجات المضادة للفطور القياسية المتوفرة حاليا محدودة بسبب السمية، ومقاومة المخدرات أكثر انتشارا، والمخدرات-المخدرات التفاعلات. ولذلك، هناك حاجة ملحة لتحديد أهداف العقاقير المضادة للفطور الجديدة التي سوف تسفر عن أفضل خيارات العلاج للمرضى المعرضة للخطر. ومع ذلك، اكتشاف أدوية جديدة تعمل على أهداف الفطرية معقد نظراً للفطريات حقيقيات النوى. وهذا يحد بدرجة كبيرة العدد من الأهداف الفطرية الخاصة بالمخدرات.
قد بينت الدراسات الأخيرة أن الميتوكوندريا هي مساهم حرجة لضراوة الفطرية والتسامح للأدوية المضادة للفطور منذ الميتوكوندريا هامة للتنفس الخلوي والتمثيل الغذائي الأكسدة وتوصيل الإشارة والمبرمج8 9، ،،من1011. التمثيل الغذائي سواء جليكوليتيك أو غير جليكوليتيك ضرورية لبقاء المبيضة في الثدييات المضيفة12،،من1314،،من1516. وعلاوة على ذلك، عدة طفرات المبيضة التي تفتقر إلى البروتينات المتقدرية، مثل Goa1، Srr1، Gem1، Sam37 إلخ قد أظهرت أن تكون معيبة في فيلامينتيشن، عامل فوعة هامة من المبيضة17، 18 , 19 , 20 , 21 , 22-وبالإضافة إلى ذلك، عرضت هذه طفرات أيضا أن يخفف لضراوة في نموذج ماوس لنشر داء المبيضات17،،من1819،20،21 ،22. وهكذا، تمثل الميتوكوندريا الفطرية هدفا جذاباً لاكتشاف المخدرات. ومع ذلك، هو التحدي دراسة الوظيفة المتقدرية في المبيضة سبب المبيضة صغيرتي السلبية23، مما يعني أنها لا تستطيع أن تعيش دون جينوم المتقدرية.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول التي يمكن استخدامها للتحقيق في وظيفة الميتوكوندريا وجليكوليتيك في المبيضة دون الحاجة إلى تنقية الميتوكوندريا. هذا الأسلوب يمكن أن يكون الأمثل أيضا للتحقيق في تأثير التلاعب بالجينات أو المغيرون الكيميائية على مسارات mitochondrial وجليكوليتيك في المبيضة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الاستقلاب المقايسة الجريان الإضافي بمثابة أداة ممتازة لقراءة وظيفة الميتوكوندريا بقياس الفسفرة (أوكسفوس)-استهلاك الأوكسجين تعتمد في الوقت الحقيقي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا التحقيق دالة glycolytic ويتم قياسه كنسبة تحمض خارج الخلية (التغير في درجة الحموضة خارج الخلية) في نفس الوقت في تحليل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
البحث في نورث كارولاينا مختبر معتمد من قبل منحة معاهد وطنية لصحة (NIH) R01AI24499، ومنحة مؤسسة صحة ولاية نيو جيرسي (نجهف)، #PC40-18.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
- Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
- Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children’s hospitals’ neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
- Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
- Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
- Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
- Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
- Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
- Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
- Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
- Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
- Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
- Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
- Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
- Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
- Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
- Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
- Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
- Brandt, M. E. . Candida and Candidiasis. , (2002).
- Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
- Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
- de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).
