Биоэнергетика расследование Candida albicans с помощью реального времени внеклеточного потока анализа
Summary
Здесь мы представляем поэтапного протокол митохондриальное дыхание и гликолитических функции в Candida Albicans расследовать с помощью анализатора дополнительный поток.
Abstract
Митохондрии являются основные органеллы для клеточного метаболизма и выживания. Целый ряд ключевых событий происходят в митохондрии, например клеточного дыхания, окислительного метаболизма, сигнала и апоптоз. Следовательно митохондриальной дисфункции, как сообщается, играть важную роль в противогрибковый препарат терпимости и вирулентности патогенных грибов. Последние данные также привели к признанию важности митохондрий как важный вклад грибковых патогенеза. Несмотря на важное значение митохондрий в грибковых биологии стандартизированные методы, чтобы понять ее функции развиты плохо. Здесь мы представляем процедуру для изучения базальной кислорода расхода (OCR), мера митохондриальное дыхание и внеклеточной подкисления ставок (ECAR), мера гликолитических функции штаммов C. albicans . Метод, описанный здесь может применяться к любой Candidaspp. штаммы без необходимости очистки митохондрий от нетронутыми грибковых клеток. Кроме того, этот протокол также может быть настроен на экран ингибиторов митохондриальных функции штаммов C. albicans .
Introduction
Инвазивные грибковые инфекции убить более 1,5 миллиона человек в год во всем мире. Этот номер находится на подъеме благодаря увеличению числа людей, живущих с нарушенной иммунитет, в том числе пожилых, недоношенных младенцев, пересадка получателей и раковых больных1. C. albicans является оппортунистических человека грибкового патогена, которая является частью человеческого микрофлоры. Он также обитает слизистой поверхности и желудочно-кишечного тракта как синантропных организм. C. albicans производит серьезное системное заболевание у людей, которые имеют иммунные недостатки, которые подверглись операции, или которые были обработаны с длиной курсы антибиотиков. Ранг видов Candida среди топ три-четыре причин внутрибольничных инфекционных заболеваний (NID) в люди2,3,4,5,6,7. Ежегодные глобальные количество Candida инфекций кровотока оценивается в ~ 400 000 случаев, с связанные смертности 46-75%1. Ежегодная смертность вследствие кандидоз — примерно 10 000 в одних только Соединенных Штатах. Степень NID, вызванные грибками отражена также в астрономические расходы пациента5. В Соединенных Штатах ежегодные расходы для лечения инвазивных грибковых инфекций превышает $2 млрд, добавляя огромную нагрузку на уже перегруженные системы здравоохранения. В настоящее время доступны стандартные противогрибковой терапии ограничены из-за токсичности, все более широкое распространение лекарственной устойчивости и наркотиков лекарственных взаимодействий. Таким образом существует настоятельная необходимость определить новые цели противогрибковый препарат, которые приведут к более вариантов лечения для пациентов высокого риска. Однако открытие новых препаратов, действующих на грибковые целей является сложным, потому что грибы являются эукариотами. Это значительно ограничивает количество наркотиков грибковых конкретных целей.
Недавние исследования показали, что Митохондрии являются критический вклад грибковых вирулентности и терпимости к противогрибковых препаратов, поскольку митохондрии имеют важное значение для клеточного дыхания, окислительного метаболизма, сигнала и апоптоза8 ,9,10,11. Метаболизм гликолитических и не гликолитических имеют важное значение для выживания C. albicans в млекопитающих принимающей12,13,14,,1516. Кроме того несколько мутантов C. albicans , хватает митохондриальных протеинов, таких как Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 и т.д. было показано неисправен в филаментацию, является важным вирулентности фактором C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Кроме того, эти мутанты были также продемонстрированы быть ослаблены для вирулентности в модели мыши распространение кандидоз17,18,19,20,21 ,22. Таким образом грибковых митохондрий представляют привлекательной мишенью для обнаружения наркотиков. Однако изучение митохондриальной функции в C. albicans является сложной задачей, потому что маленькая негативные23, что означает, что она не может выжить без митохондриального генома C. albicans .
Здесь мы описываем протокол, который может использоваться для изучения функции митохондрий и гликолитических в C. albicans без необходимости очистки митохондрий. Этот метод также может быть оптимизирован для исследовать влияние генетических манипуляций или химические модуляторы на митохондриальной и гликолитических путей в C. albicans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Биоэнергетика дополнительный поток пробирного служит прекрасным инструментом для чтения из митохондрий путем измерения Оксидативное фосфорилирование (OXPHOS)-потребление зависит от кислорода в режиме реального времени. Кроме того гликолитических функция, которая измеряется как показ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в лаборатории НК поддерживается национальных институтов здравоохранения (НИЗ) Грант R01AI24499 и Грант фонда здравоохранения Нью-Джерси (NJHF), #PC40-18.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
- Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
- Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children’s hospitals’ neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
- Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
- Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
- Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
- Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
- Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
- Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
- Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
- Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
- Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
- Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
- Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
- Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
- Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
- Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
- Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
- Brandt, M. E. . Candida and Candidiasis. , (2002).
- Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
- Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
- de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).
