ביו-energetics החקירה של קנדידה אלביקנס משתמש בזמן אמת חוץ-תאית השטף ניתוח
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול stepwise לחקור את הנשימה מיטוכונדריאלי והתפקוד glycolytic ב קנדידה אלביקנס באמצעות עם מנתח נוסף השטף.
Abstract
המיטוכונדריה הם organelles חיוני כדי להפוך את חילוף החומרים הסלולר הישרדות. מגוון רחב של אירועי מפתח יתקיים המיטוכונדריה, כגון נשימה תאית, מטבוליזם חמצוני, אותות אפופטוזיס. כתוצאה מכך, תפקוד מיטוכונדריאלי הוא דיווח יש תפקיד חשוב סבילות נגד פטריות, התקפה אלימה של פטריות פתוגניים. נתונים עדכניים הובילו גם ההכרה על החשיבות של המיטוכונדריה כמו תורם חשוב בפתוגנזה פטרייתי. למרות החשיבות של המיטוכונדריה בביולוגיה פטרייתי, שיטות מתוקננים כדי להבין את הפונקציה שלה הן מפותחות. כאן, אנו מציגים את הליך ללמוד שיעור צריכת החמצן הבזליים (OCR), מידת הנשימה מיטוכונדריאלי, ו המחירים חוץ-תאית acidification (ECAR), מדד של פונקציית glycolytic אלביקנס ג זנים. השיטה המתוארת במסמך זה ניתן ליישם כל זני Candidaspp. ללא צורך לטהר את המיטוכונדריה מתאי פטרייתי ללא פגע. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם אישית עבור מעכבי של פונקציית מיטוכונדריאלי זנים אלביקנס ג מסך.
Introduction
זיהומים פטרייתיים פולשנית להרוג מעל 1.5 מיליון אנשים בשנה ברחבי העולם. המספר הזה הוא בעלייה בשל עלייה במספר האנשים החיים עם חסינות פרוץ, לרבות תינוקות קשישים, מוקדמת, השתלת הנמענים, חולי סרטן1. ג אלביקנס הוא הזדמנותית פטריות פתוגניות זה חלק microflora האדם. הוא שוכן גם ומשטחים הרירית של מערכת העיכול כאורגניזם commensal. אלביקנס ג מייצרת מחלה מערכתית קשה אצל אנשים שיש להם ליקויים החיסונית, אשר עברו ניתוח, או מי שטופלו עם קורסים ארוכים של אנטיביוטיקה. הדרגה מינים קנדידה בין הגורמים המובילים שלושה או ארבעה nosocomial מחלות זיהומיות (ניד) ב בני אדם2,3,4,5,6,7. מספר זיהומים קנדידה למחזור הדם העולמי השנתי מוערך ~ 400,000 מקרים, עם בהירושימה המשויך של 46-75%1. התמותה השנתי עקב קנדידה הוא בערך 10,000 בארצות הברית לבדה. היקף ניד הנגרמת על ידי פטריות משתקפת גם הוצאות אסטרונומיות החולה5. בארצות הברית, על הטיפול של זיהומים פטרייתיים פולשנית הוצאות שנתי עולה 2 מיליארד דולר, הוספת זן ענק כבר עומס מערכת הבריאות. כיום, טיפולים נגד פטריות סטנדרטיים זמינים מוגבלות בשל רעילות, תרופתיים נפוץ יותר ויותר, סמים-תרופתיות. לכן, יש צורך דחוף לזיהוי מטרות תרופה נגד פטריות חדש זה יביא באפשרויות טיפול טוב יותר לחולים בסיכון גבוה. עם זאת, הגילוי של תכשירים חדשים על מטרות פטרייתי הוא מסובך כי פטריות פרוקריוטים. זה מאוד מגביל את מספר מטרות ספציפיות פטרייתי סמים.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי המיטוכונדריה הם תורם קריטי לאלימות ולגרימת פטרייתי עמידות לתרופות נגד פטריות מאז המיטוכונדריה חשובים נשימה תאית, מטבוליזם חמצוני, אותות של אפופטוזיס8 ,9,10,11. מטבוליזם glycolytic והן הלא-glycolytic חיוניים להישרדותה של אלביקנס ג המארח בתרבית של12,13,14,15,16. יתר על כן, מספר מוטציות אלביקנס ג חסר חלבונים מיטוכונדריאלי, כגון Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 וכו ‘ הוכחו להיות פגום בתוך filamentation, גורם חשוב התקפה אלימה של אלביקנס ג17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. בנוסף, המוטנטים האלה הוצגו גם כדי להיות הקלוש של התקפה אלימה במודל של עכברים של המופץ קנדידה17,18,19,20,21 ,22. לפיכך, המיטוכונדריה פטרייתי מייצגים ליעד אטרקטיבי עבור גילוי תרופות. עם זאת, המחקר של פונקציית מיטוכונדריאלי אלביקנס ג הוא מאתגר כי אלביקנס ג פטיט שלילי23, מה שאומר כי זה לא יכול לשרוד בלי גנום מיטוכונדריאלי.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את פונקציית מיטוכונדריאלי, glycolytic אלביקנס ג ללא צורך לטהר את המיטוכונדריה. ניתן למטב בשיטה זו גם כדי לחקור את ההשפעה של מניפולציה גנטית או מאפננים כימי על מסלולים מיטוכונדריאלי ו glycolytic ב ג אלביקנס.
Protocol
Representative Results
Discussion
ביואנרגיה השטף נוספת assay משמש כלי מצוין כדי לקרוא את הפונקציה מיטוכונדריאלי על ידי מדידת זרחון חמצוני (OXPHOS)-צריכת חמצן התלויים בזמן אמת. בנוסף, פונקציה glycolytic, אשר נמדד כמו שיעור חוץ-תאית acidification (שינוי ב- pH חוץ-תאית) יכול ייחקרו גם במקביל בניתוח בזמן אמת.
ציפוי מוצלחת של אלבי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר במעבדה NC נתמך על ידי מענק הלאומי מכונים לבריאות (NIH) R01AI24499 מענק קרן בריאות ניו ג’רזי (NJHF), PC40-18.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
- Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
- Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children’s hospitals’ neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
- Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
- Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
- Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
- Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
- Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
- Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
- Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
- Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
- Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
- Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
- Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
- Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
- Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
- Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
- Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
- Brandt, M. E. . Candida and Candidiasis. , (2002).
- Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
- Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
- de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).
