Indagine di bio-energetica di Candida albicans utilizzando extracellulare Flux analisi Real-Time
Summary
Qui, presentiamo un protocollo graduale per studiare la respirazione mitocondriale e la funzione glicolitica in Candida Albicans utilizzando un analizzatore di flusso supplementare.
Abstract
I mitocondri sono organelli essenziali per il metabolismo cellulare e la sopravvivenza. Una varietà di eventi chiave si svolgono nei mitocondri, come la respirazione cellulare, il metabolismo ossidativo, trasduzione del segnale e apoptosi. Di conseguenza, la disfunzione mitocondriale è segnalata per svolgere un ruolo importante nella tolleranza al farmaco antifungino e virulenza dei patogeni fungini. Dati recenti hanno anche portato al riconoscimento dell’importanza dei mitocondri come un importante contributo alla patogenesi fungine. Nonostante l’importanza dei mitocondri in biologia fungina, sono scarsamente sviluppati metodi standardizzati per capire la sua funzione. Qui, presentiamo una procedura per studiare il tasso di consumo di ossigeno basale (OCR), una misura della respirazione mitocondriale e tassi di acidificazione extracellulare (ECAR), una misura della funzione glicolitica in ceppi di c. albicans . Il metodo descritto qui può essere applicato per eventuali ceppi Candidaspp. senza la necessità di purificare i mitocondri da cellule fungine intatte. Inoltre, questo protocollo può anche essere personalizzato alla schermata per inibitori della funzione mitocondriale in ceppi di c. albicans .
Introduction
Infezioni fungine invasive uccidono oltre 1,5 milioni di persone ogni anno in tutto il mondo. Questo numero è in aumento a causa di un aumento del numero di persone che vivono con immunità compromessa, inclusi i neonati prematuri, anziani, destinatari del trapianto e cancro pazienti1. C. albicans è un patogeno opportunista di fungo umano che fa parte della microflora umana. Abita anche le superfici mucose e il tratto gastrointestinale come un organismo commensale. C. albicans produce malattia sistemica grave in persone che hanno deficit immunitari, che hanno subito la chirurgia, o che sono state trattate con lunghi cicli di antibiotici. Il rango di specie di Candida tra le tre cause principali di malattie infettive nosocomiali (NID) in esseri umani2,3,4,5,6,7. Il numero globale annuale delle infezioni da Candida flusso sanguigno è stimata intorno a ~ 400.000 casi, con mortalità associata di 46-75%1. La mortalità annua a causa della candidosi è all’incirca 10.000 negli Stati Uniti da solo. Nella misura del NID causate da funghi si riflette anche nella astronomico spese paziente5. Negli Stati Uniti, la spesa annua per il trattamento di infezioni fungine invasive supera $ 2 miliardi, l’aggiunta di uno sforzo enorme per sistema sanitario già oberati di lavoro. Attualmente, le terapie antifungine standard disponibili sono limitate a causa di tossicità, sempre più diffuso di farmacoresistenza e interazioni farmaco-farmaco. Di conseguenza, c’è un urgente bisogno di identificare nuovi bersagli di farmaco antifungino che si tradurrà in migliori opzioni di trattamento per pazienti ad alto rischio. Tuttavia, la scoperta di nuovi farmaci che agiscono su bersagli fungine è complicata perché i funghi sono eucarioti. Questo limita notevolmente il numero di bersagli farmacologici specifici fungine.
Recenti studi hanno indicato che i mitocondri sono un contributo critico alla virulenza fungina e la tolleranza alle droghe antifungose poiché i mitocondri sono importanti per la respirazione cellulare, il metabolismo ossidativo, trasduzione del segnale e apoptosi8 ,9,10,11. Metabolismo glicolitico sia non-glicolitico sono essenziali per la sopravvivenza dei albicans del c. nel mammifero ospite12,13,14,15,16. Inoltre, diversi mutanti di c. albicans carente di proteine mitocondriali, come Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 ecc. sono stati indicati per essere difettoso in filamentazione, un fattore di virulenza importante di albicans del c.17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Inoltre, questi mutanti inoltre sono stati indicati per essere attenuato per virulenza in un modello murino di diffusi candidosi17,18,19,20,21 ,22. Così, i mitocondri fungini rappresentano un obiettivo attraente per la scoperta di nuovi farmaci. Tuttavia, lo studio della funzione mitocondriale in c. albicans è impegnativo, perché c. albicans è petite negativo23, che significa che essa non può sopravvivere senza il genoma mitocondriale.
Qui, descriviamo un protocollo che può essere utilizzato per studiare la funzione mitocondriale e glicolitica a albicans del c. senza la necessità di purificare i mitocondri. Questo metodo può anche essere ottimizzato per studiare l’effetto della manipolazione genetica o modulatori chimici sulle vie mitocondriale e glicolitiche in c. albicans.
Protocol
Representative Results
Discussion
La bioenergetica analisi flusso supplementare serve come un ottimo strumento per leggere la funzione mitocondriale misurando la fosforilazione ossidativa (OXPHOS)-consumo di ossigeno dipendenti in tempo reale. Inoltre, una funzione glicolitica che viene misurata come un tasso di acidificazione extracellulare (cambiamento del pH extracellulare) può anche essere studiata allo stesso tempo nell’analisi in tempo reale.
Placcatura successo di c. albicans nella piastra di dosaggio è uno d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ricerca nel laboratorio di NC è sostenuta da una sovvenzione del National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 e una sovvenzione di New Jersey Health Foundation (NJHF), n #PC40-18.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
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