Investigação de bio-energética de Candida albicans usando real-time extracelular fluxo análise
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo gradual para investigar a respiração mitocondrial e função glicolítico em Candida Albicans usando um analisador de fluxo extra.
Abstract
As mitocôndrias são organelas essenciais para o metabolismo celular e a sobrevivência. Uma variedade de eventos chaves ocorrem nas mitocôndrias, tais como a respiração celular, metabolismo oxidativo, transdução de sinal e apoptose. Por conseguinte, disfunção mitocondrial é relatada para desempenhar um papel importante na tolerância de droga antifúngica e virulência de fungos patogênicos. Dados recentes também levaram ao reconhecimento da importância das mitocôndrias como um contribuinte importante para a patogênese fúngica. Apesar da importância das mitocôndrias em biologia de fungosa, métodos padronizados para entender sua função estão pouco desenvolvidos. Aqui, apresentamos um procedimento para estudar a taxa de consumo de oxigênio basal (OCR), uma medida da respiração mitocondrial e taxas de acidificação do extracelular (ECAR), uma medida da função glicolítico em cepas de c. albicans . O método aqui descrito pode ser aplicado a qualquer Candidaspp. tensões sem a necessidade de purificar a mitocôndria das células fúngicas intactas. Além disso, esse protocolo também pode ser personalizado para triagem de inibidores da função mitocondrial em cepas de c. albicans .
Introduction
Infecções fúngicas invasivas matam mais 1,5 milhões de pessoas por ano em todo o mundo. Este número está a aumentar devido ao aumento do número de pessoas que vivem com imunidade comprometida, incluindo os idosos, prematuros bebês, transplantados e pacientes de câncer1. C. albicans é um patógeno oportunista de fungo humano que faz parte da microflora humana. Habita também superfícies mucosas e do trato gastrointestinal como um organismo comensal. C. albicans produz doença sistêmica grave em pessoas que têm deficiências imunitárias, que se submeteram à cirurgia, ou que tenham sido tratados com longos cursos de antibióticos. A classificação de espécies de Candida entre as causas de topo três ou quatro das doenças infecciosas nosocomiais (NID) em seres humanos,2,3,4,5,6,7. O número global anual de infecções da corrente sanguínea por Candida é estimado em ~ 400.000 casos, com mortalidade associada de 46-75%1. A mortalidade anual por causa da candidíase é aproximadamente 10.000 nos Estados Unidos sozinho. A extensão do NID causada por fungos também se reflete em gastos astronômicos de paciente5. Nos Estados Unidos, a despesa anual para o tratamento de infecções fúngicas invasivas supera US $ 2 bilhões, adicionando um esforço enorme para o sistema de saúde já sobrecarregado. Atualmente, terapias antifúngicas padrão disponíveis são limitadas por causa da resistência a drogas cada vez mais prevalente, toxicidade e interações medicamentosas. Portanto, há uma necessidade urgente de identificar novos alvos de drogas antifúngicas que resultarão em melhores opções de tratamento para pacientes de alto risco. No entanto, a descoberta de novas drogas atuando em alvos fúngicos é complicada, porque os fungos são eucariontes. Isto grandemente limita o número de alvos de drogas de fungos específicos.
Estudos recentes têm indicado que as mitocôndrias são um contribuinte crítico para a virulência de fungo e tolerância às drogas antifúngicas, desde que as mitocôndrias são importantes para a respiração celular, metabolismo oxidativo, transdução de sinal e apoptose8 ,9,10,11. Metabolismo glicolítico e não-glicolíticas são essenciais para a sobrevivência de c. albicans no hospedeiro mamífero12,13,14,15,16. Além disso, vários mutantes de c. albicans , falta de proteínas mitocondriais, tais como Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc foram mostrados para ser defeituoso em filamentação, um factor de virulência importante de c. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Além disso, esses mutantes também foram mostrados para ser atenuado para virulência em um modelo do rato disseminada candidíase17,18,19,20,21 ,22. Assim, fungosas mitocôndrias representam um alvo atraente para a descoberta da droga. No entanto, o estudo da função mitocondrial em c. albicans é um desafio porque c. albicans é petite negativo23, que significa que não pode sobreviver sem o genoma mitocondrial.
Aqui, descrevemos um protocolo que pode ser usado para investigar a função mitocondrial e glicolítico em c. albicans , sem a necessidade de purificar as mitocôndrias. Esse método também pode ser otimizado para investigar o efeito da manipulação genética ou moduladores químicos sobre vias mitocondriais e glicolíticas em c. albicans.
Protocol
Representative Results
Discussion
A bioenergética ensaio de fluxo extra serve como uma excelente ferramenta para ler a função mitocondrial medindo fosforilação oxidativa (OXPHOS)-consumo de oxigênio dependente em tempo real. Além disso, uma função glicolítico que é medida como uma taxa de acidificação do extracelular (alteração do pH extracelular) também pode ser investigada ao mesmo tempo em análise em tempo real.
Bem sucedido chapeamento de c. albicans em placa de ensaio é um dos passos críticos n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pesquisa no laboratório de NC é suportada por uma concessão do National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 e uma bolsa da Fundação de saúde de Nova Jersey (NJHF), #PC40-18.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
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