Bio-energetik undersøgelse af Candida albicans ved hjælp af Real-time ekstracellulære Flux analyse
Summary
Vi præsenterer her, en trinvis protokol for at undersøge den mitokondrielle respiration og glycolytic funktion i Candida Albicans ved hjælp af en ekstra flux analyzer.
Abstract
Mitokondrier er væsentlige organelles for cellulære metabolisme og overlevelse. En række vigtige begivenheder sted i mitokondrierne, cellulær respiration, oxidative metabolisme, signaltransduktion og apoptose. Derfor er mitokondriel dysfunktion rapporteret til at spille en vigtig rolle i svampedræbende stof tolerance og virulens af patogene svampe. De seneste data har også ført til anerkendelse af betydningen af mitokondrier som en vigtig bidragyder til svampe patogenese. Trods vigtigheden af mitokondrier i svampe biologi, er standardiserede metoder til at forstå dens funktion dårligt udviklet. Vi præsenterer her, en procedure for at studere basal ilt forbrugssats (OCR), en foranstaltning af mitokondrie respiration og ekstracellulære forsuring satser (ECAR), en foranstaltning af glykolytiske funktion i C. albicans stammer. Den metode beskrevet heri kan anvendes til enhver Candidaspp. stammer uden at skulle rense mitokondrier fra de intakte svampe celler. Desuden, denne protokol kan også tilpasses til skærmen for hæmmere af mitokondrie-funktionen i C. albicans stammer.
Introduction
Invasive svampeinfektioner dræbe over 1,5 millioner mennesker om året på verdensplan. Dette tal er stigende på grund af en stigning i antallet af mennesker, der lever med kompromitteret immunitet, herunder ældre, forhastet spædbørn, transplanterede og kræft patienter1. C. albicans er en opportunistisk menneskelige svampe patogen, der er en del af den menneskelige mikroflora. Det lever også slimhindeinfektioner og mave-tarmkanalen som en commensal organisme. C. albicans producerer alvorlig systemisk sygdom i mennesker, der har immun mangler, der har gennemgået kirurgi, eller der er blevet behandlet med lange kurser af antibiotika. Candida arter rang blandt de top tre til fire årsager til nosokomielle infektionssygdomme (NID) i mennesker2,3,4,5,6,7. Årlige globale antallet af Candida infektioner i blodet er anslået til at være tilfælde, ~ 400.000, med tilknyttede MORTALITET på 46-75%1. Den årlige dødelighed på grund af candidiasis er omtrent 10.000 i USA alene. Omfanget af NID forårsaget af svampe afspejles også i astronomiske patient udgifter5. I USA overgår den årlige udgift til behandling af invasive svampeinfektioner $2 milliarder, tilføje en stor stamme til allerede overbebyrdet sundhedsvæsen. I øjeblikket er tilgængelige standard svampedræbende behandlingsformer begrænset på grund af toksicitet, stadig mere udbredt resistens og stof-drug interaktioner. Derfor er der et presserende behov for at identificere nye svampedræbende stof mål, der vil resultere i bedre behandlingsmuligheder for højrisiko patienter. Opdagelsen af nye lægemidler på svampe mål er imidlertid komplicerede, fordi svampe er eukaryoter. Dette begrænser stærkt antallet af svampe-specifikke stof mål.
Nylige undersøgelser har vist, at mitokondrier er en kritisk bidragyder til svampe virulence og tolerance at svampemidler da mitokondrier er vigtig for cellulære respiration, oxidative metabolisme, signaltransduktion og apoptose8 ,9,10,11. Både glykolytiske og ikke-glycolytic stofskifte er afgørende for overlevelse af C. albicans i pattedyr vært12,13,14,15,16. Desuden har flere C. albicans mutanter mangler mitokondrielle proteiner, såsom Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. vist sig at være defekt i filamentation, en vigtig virulens faktor af C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Desuden disse mutanter blev også vist sig at være svækket til virulens i en musemodel af formidlet candidiasis17,18,19,20,21 ,22. Svampe mitokondrier udgør således, et attraktivt mål for drug discovery. Men studiet af mitokondrie-funktionen i C. albicans udfordrende for C. albicans er petite negative23, hvilket betyder, at det ikke kan overleve uden den mitokondrielle genom.
Her, beskriver vi en protokol, der kan bruges til at undersøge mitokondrie og glycolytic funktion i C. albicans uden at skulle rense mitokondrier. Denne metode kan også være optimeret til at undersøge effekten af genetiske manipulation eller kemiske modulatorer på mitokondrie og glycolytic veje i C. albicans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bioenergetik ekstra flux assay fungerer som et fremragende værktøj til at læse den mitokondrielle funktion ved at måle oxidativ fosforylering (OXPHOS)-afhængig af iltforbrug i realtid. En glycolytic funktion, som måles som en ekstracellulære forsuring sats (ændring af ekstracellulære pH) kan derudover også undersøges på samme tid i realtid analyse.
Vellykket plating af C. albicans i assay plade er en af de afgørende trin i analysen fordi inkubation af celler i PDL overtru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i NC lab er støttet af en National Institutes of Health (NIH) grant R01AI24499 og New Jersey Health Foundation (NJHF) tilskud, #PC40-18.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
- Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
- Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children’s hospitals’ neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
- Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
- Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
- Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
- Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
- Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
- Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
- Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
- Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
- Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
- Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
- Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
- Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
- Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
- Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
- Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
- Brandt, M. E. . Candida and Candidiasis. , (2002).
- Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
- Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
- de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).
