Bio-energetikk undersøkelse av Candida albicans bruker Real-time ekstracellulære Flux analyse
Summary
Her presenterer vi en gradvis protokoll for å undersøke mitokondrie åndedrett og glycolytic funksjonen i Candida Albicans bruker en ekstra fluks analyserer.
Abstract
Mitokondrier er viktig organelles for cellenes stoffskifte og overlevelse. En rekke viktige hendelser skje i mitokondrier, som cellular respirasjon, oksidativt metabolisme, signaltransduksjon og apoptose. Følgelig rapporteres mitokondrie dysfunksjon å spille en viktig rolle i soppdrepende narkotika toleranse og virulens av patogene sopp. Nyere data har også ført til anerkjennelse av betydningen av mitokondrier som en viktig bidragsyter til sopp patogenesen. Til tross for betydningen av mitokondrier i fungal biologi, er standardiserte metoder å forstå dens funksjon dårlig utviklet. Her presenterer vi en prosedyre for å studere basale oksygen forbruksraten (OCR), et mål på mitokondrie åndedrett, og ekstracellulære forsuring priser (ECAR), et mål på glycolytic funksjon i C. albicans stammer. Metoden beskrevet her kan brukes på alle Candidaspp. stammer uten å rense mitokondrier fra intakt fungal cellene. Videre denne protokollen kan også tilpasses til skjermen for hemmere av mitokondrie funksjon i C. albicans stammer.
Introduction
Invasiv soppinfeksjoner drepe over 1,5 millioner mennesker hvert år over hele verden. Dette nummeret er på økningen skyldes en økning i antall mennesker med nedsatt immunitet, inkludert eldre, premature spedbarn, transplantasjon mottakere og kreft pasienter1. C. albicans er en opportunistisk menneskelige fungal patogen som er en del av menneskelig mikroflora. Det bor også mucosal overflater og fordøyelsessystemet som en commensal organisme. C. albicans produserer alvorlig systemisk sykdom i folk som har immun mankoen, som har gjennomgått kirurgi eller som har blitt behandlet med lang kurs av antibiotika. Candida arter rangerer blant topp tre til fire årsakene til nosocomial smittsomme sykdommer (NID) i Human2,3,4,5,6,7. Det årlige globale antallet Candida blodbanen infeksjoner er anslått til ~ 400 000 tilfeller med tilknyttede dødelighet 46-75%1. Den årlige dødeligheten på grunn av candidiasis er omtrent 10 000 i USA alene. Omfanget av NID forårsaket av sopp gjenspeiles i astronomiske pasienten utgifter5. I USA overgår årlige kostnaden for behandlingen av invasiv soppinfeksjoner $2 milliarder, legger en enorm belastning til allerede overbelastet helsevesenet. Foreløpig er tilgjengelig standard soppdrepende terapi begrenset på grunn av toksisitet, stadig mer utbredt resistens og narkotika-interaksjoner. Derfor er det et presserende behov for å identifisere nye soppdrepende narkotika mål som fører til bedre behandlingstilbud for høy-risiko pasienter. Oppdagelsen av nye stoffer opptrer på sopp mål er imidlertid komplisert fordi sopp eukaryoter. Dette begrenser sterkt antall sopp-spesifikke narkotika mål.
Nyere studier har indikert at mitokondrier er en viktig bidragsyter til sopp virulens og toleranse soppdrepende narkotika siden mitochondria er viktig for cellular respirasjon, oksidativt metabolisme, signaltransduksjon og apoptose8 ,9,10,11. Både glycolytic og ikke-glycolytic metabolisme er avgjørende for overlevelse av C. albicans i de pattedyr vert12,13,14,15,16. Videre har flere C. albicans mutanter mangler mitokondrie proteiner, slik som Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. vist seg å være defekt i filamentation, en viktig virulens faktor C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. I tillegg disse mutanter ble også vist å dempes for virulens i en musemodell spres candidiasis17,18,19,20,21 ,22. Dermed representerer fungal mitokondrier et attraktivt mål for medisiner. Imidlertid er studiet av mitokondrie funksjon i C. albicans utfordrende fordi C. albicans er petite negative23, som betyr at det ikke kan overleve uten mitokondrie genomet.
Her beskriver vi en protokoll som kan brukes til å undersøke mitokondrie og glycolytic funksjon i C. albicans uten å rense mitokondrier. Denne metoden kan også optimeres for å undersøke effekten av genetisk manipulasjon eller kjemiske modulatorer på mitokondrie og glycolytic stier i C. albicans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bioenergi ekstra fluks analysen fungerer som et utmerket verktøy for å lese ut funksjonen mitokondrie ved å måle oxidative fosforylering (OXPHOS)-avhengige oksygenforbruk i sanntid. I tillegg kan en glycolytic funksjon som måles som en ekstracellulære forsuring rate (endre i ekstracellulære pH) også undersøkes samtidig i sanntid analyse.
Vellykket plating av C. albicans i analysen platen er en av de viktige trinnene i analysen fordi inkubasjonstiden for cellene i PDL belagt p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i NC lab støttes av National Institutes of Health (NIH) stipend R01AI24499 og New Jersey Health Foundation (NJHF) stipend, #PC40-18.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
- Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
- Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children’s hospitals’ neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
- Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
- Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
- Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
- Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
- Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
- Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
- Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
- Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
- Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
- Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
- Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
- Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
- Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
- Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
- Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
- Brandt, M. E. . Candida and Candidiasis. , (2002).
- Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
- Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
- de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).
