Stimulation électrique et mécanique simultanée pour promouvoir le potentiel de cellules Cardiomyogénique
Summary
Nous présentons ici un protocole pour la formation d’une population de cellules à l’aide de stimuli électriques et mécaniques, émulant la physiologie cardiaque. Cette stimulation électromécanique améliore le potentiel de cardiomyogénique des cellules traitées et est une stratégie prometteuse pour autre thérapie cellulaire, modélisation de la maladie et dépistage des drogues.
Abstract
Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans les pays développés. Par conséquent, la demande pour des thérapies efficaces cellule cardiaque a motivé des chercheurs dans les domaines de la bio-ingénierie et de cellules souches pour développer en vitro haute-fidélité humaine myocarde pour la recherche fondamentale et les applications cliniques. Cependant, le phénotype immature des cellules cardiaques est une limitation sur l’obtention de tissus qui imitent fonctionnellement le myocarde adult, qui se caractérise principalement par des signaux mécaniques et électriques. Ainsi, le but du présent protocole est de préparer et de maturité de la population de cellules cibles par le biais de la stimulation électromécanique, récapitulant les paramètres physiologiques. Génie tissulaire cardiaque évolue vers des approches plus biologiques, et des stratégies fondées sur des stimuli biophysiques, ainsi, sont accélèrent. Le dispositif mis au point à cet effet est unique et permet individuelle ou simultanée électrique et mécanique stimulation, soigneusement caractérisés et validées. En outre, bien que la méthodologie a été optimisée pour ce stimulateur et une population de cellules spécifiques, il peut être facilement adaptée à d’autres dispositifs et les lignées cellulaires. Les résultats présentés ici offrent la preuve de l’engagement cardiaque accrue de la population cellulaire après stimulation électromécanique. Cellules stimulées électro-mécaniquement montrent une augmentation de l’expression des principaux marqueurs cardiaques, y compris des gènes précoces, structurales et régulatrices du calcium. Ce conditionnement cellulaire pourrait être utile pour encore la thérapie régénératrice cellulaire, modélisation de la maladie et dépistage des drogues de haut débit.
Introduction
La fonction cardiaque est basée sur le couplage de l’excitation électrique et mécanique contraction. Brièvement, jonctions intercellulaires cardiomyocyte permettent de propagation du signal électrique pour produire des contractions presque synchrones du coeur qui pompe le sang systémique et à travers le système pulmonaire. Les cellules cardiaques, subissent ainsi, électriques et mécaniques des forces qui régissent la fonction cellulaire et de l’expression du gène. En conséquence, plusieurs groupes ont tenté de développer des plates-formes de culture qui imitent l’environnement physiologique cardiaque pour comprendre le rôle de stimulation mécanique et électrique sur le développement cardiaque, fonction et la maturation. In vitro les stimulations électriques et mécaniques individuellement ont été appliquées largement dans l’ingénierie du tissu cardiaque pour améliorer les propriétés fonctionnelles, augmenter la maturation cellulaire ou améliorer le couplage cellule-cellule et calcium manipulation1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Néanmoins, climatisation electromecanique synchrone reste inexploitée en raison du défi de mettre au point un protocole et un stimulateur et l’ optimisation obligatoire22.
Les travaux préliminaires adressées stimulation électromécanique comme une combinaison de la stimulation électrique et de la perfusion de médias ; Toutefois, le flux n’implique pas la déformation axée sur la souche typique du remplissage ventriculaire23,24,25. Plus tard, les approches physiologiques plus combinée des stimuli électriques avec déformation physique ou d’étirement pour imiter les isovolumétriques contraction26,27,28,29,30 ,,31. Feng Al décrit la première démonstration de stimulation électromécanique en 2005, rapports améliorés cardiomyocyte les propriétés size et contractiles26. Wang Al prétraitées avec des cellules souches mésenchymateuses avec la 5-azacytidine et appliqué simultanée climatisation électrique et mécanique, amélioration de la recellularization, la viabilité cellulaire, différenciation cardiaque et tissu transformant le27. Depuis ces publications, plusieurs groupes ont rapporté sur la stimulation électromécanique de monocouches de cellules ou ingénierie des tissus (p. ex., noir28, Vunjak-Novakovic29,31et notre groupe30) avec la premières cellules climatisées testé in vivo30. En bref, Morgan et noir testé plusieurs combinaisons de stimuli électriques et mécaniques, déclaration que le moment entre les stimulations était crucial car retardée combinée stimulation électromécanique ont donné les meilleurs résultats28. Ensuite, Godier-Furnémont et collaborateurs optimisé un protocole de stimulation électromécaniques pour constructions muscle cœur machiné de cellules cardiaques de rat néonatal et atteint, pour la première fois, une de relation positive force-fréquence29. Par la suite, notre groupe a indiqué qu’électro-mécaniquement préconditionnés cellules augmenté l’expression de marqueurs cardiaques principal in vitro et large bénéfique effets in vivo, tels qu’améliore la fonction cardiaque ou augmente la densité des navires dans l’infarctus frontière région30. La publication la plus récente a démontré que les tissus cardiaques de cardiomyocytes dérivés tige-cellule soumis à atteint une maturation niveau plus proche de l’humain adulte cardiaque structure et la fonction31aux électromécaniques. En outre, les plates-formes alternatives de stimulation en trois dimensions représentent électroactifs échafaudages qui fournissent l’électricité, mécanique et repères topographiques aux cellules attaché32. En outre, déformation mécanique (cellulaire monocouche qui s’étend et compression) peut également être induite avec électrodes extensibles imitant les conditions physiologiques normales, ainsi que des conditions extrêmes,33.
Par conséquent, le raisonnement est que des stimuli électromécaniques in vitro selon les conditions physiologiques pourraient renforcer le potentiel de cardiomyogénique d’une cellule. En effet, cette stimulation pourrait une prestation plus intégrations de cellules thérapeutiques dans le myocarde dans un scénario clinique ou la maturation des tissus pour des applications de dépistage des drogues.
En outre, nous avons isolé et caractérisé une population de cellules progénitrices de dérivées du tissu adipeux humain de cardiaque d’origine (ATDPCs cardiaques)34. Ces cellules sont situées dans la graisse épicardique. Ces cellules affichent des effets histopathologiques et fonctionnels bénéfiques dans le traitement de l’infarctus du myocarde et aussi maintient la différenciation cardiaque et endothéliale potentiel. 30 , 35. nous avons supposé que ces bénéfices augmenteraient après stimulation biophysique.
Par conséquent, nous avons mis au point un dispositif et un régime de stimulation pour la population de cellules d’intérêt et ont étudié les effets. Ce protocole électromécanique est une nouvelle stratégie pour induire la cellule active, qui s’étend de façon stérile et non invasive par rapport aux précédentes publications36, en combinaison avec une stimulation de champ électrique. La technique rapportée ici explique en détail l’appareil et la méthode utilisée pour la stimulation électrique, mécanique et électromécanique des cellules.
Cet appareil peut fournir la stimulation électrique et mécanique, indépendamment ou simultanément. La stimulation est effectuée avec une nouvelle approche non invasive et aseptique qui inclut le support de cellule pré-stérilisé, électrodes placées à l’intérieur d’une plaque de culture standard et une plate-forme qui induit les forces mécaniques et électriques (Figure 1).
La plate-forme peut contenir jusqu’à six culture plaques et se compose d’une structure “sandwich” de poly(methyl methacrylate) découpé au laser et des morceaux de carte de circuit imprimé. Le prototype de plate-forme repose sur une combinaison d’une monophasique programmable commandé par ordinateur stimulateur électrique, une carte de circuit imprimé pour la connexion robuste des électrodes et six 10 x 10 mm x 5 mm nickelé-correction de néodyme aimants placés près d’un côté des plaques de culture. Il y a également une barre en aluminium avec six aimants conduites (même modèle) placé en face de l’autre côté des plaques de culture et s’installe avec un servomoteur linéaire. Le moteur est entraîné par un contrôleur de moteur, opéré via un port RS-232 par des logiciels commerciaux (voir la Table des matières). Par le biais de l’interface utilisateur et stimulateur programmable, il est possible de programmer l’intensité électrique, la durée de l’impulsion et de fréquence, la fréquence de stimulation mécanique, son rapport cyclique, le nombre d’impulsions, l’amplitude de l’impulsion (excursion aimant), et la pente.
Figure 1 : Stimulateur électromécanique. (A), PDMS construction utilisée pour le conditionnement de la cellule. Dessin (B) de la construction PDMS, y compris les électrodes et les aimants. (C) détail de la platine (plate-forme) utilisée pour effectuer le conditionnement électromécanique. Ce panneau a été modifié par Llucià-Valldeperas Al30. (D) photo de la stimulation électromécaniques plate-forme et interface utilisateur (ordinateur). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Tant le stimulateur et le mode de conditionnement électromécanique sont décrites en détail dans deux brevets internationaux, WO-2013185818-A137 et38de la WO-2017125159-A1.
Le silicone biocompatible constructions conçues pour apporter un soutien structurel aux cellules, électrodes et aimants ont été décrits précédemment10,21. En bref, ils se composent de polydiméthylsiloxane (PDMS), moulé et durci à la température ambiante, avec un module d’Young de 1,3 MPa, proches des niveaux physiologiques. La construction contient un bassin de culture cellulaire dans une zone flexible (10 x 10 x 2 mm), deux fentes transversales intérieures pour tenir les électrodes et deux intégré 6 x 2 mm x 4 mm nickelé néodyme. Les électrodes sont construits avec 0,2 mm platine fil torsadé autour d’une 2 x 3 mm x 12 le polytétrafluoroéthylène (PTFE) de mm base bar (21 cm par électrode, environ 23 tours) et mis à part et d’autre de la zone flexible pour créer un champ électrique pour induire stimulation électrique. Étirement mécanique est obtenue par une attraction magnétique entre les aimants intégrés dans le support et aimants externes placés à côté de la plaque de culture et sur le bras en aluminium mobile. De cette façon, le soutien de la cellule peut être étendu sans casser la barrière stérile. Cette approche convient à une monocouche de cellules, mais pourrait être adaptée pour des constructions en trois dimensions, aussi bien.
En outre, un modèle régulier pourrait être imprimé où les cellules sont ensemencées, à l’aide d’un réseau de diffraction gouverné (1 250 rainures/mm). La visualisation directe des cellules cultivées sur la construction PDMS sous fond clair et microscopes fluorescents est possible en raison de sa transparence et son épaisseur 0,5 mm. En l’espèce, la piscine de la culture PDMS a un motif de surface vertical, perpendiculaire à la force d’étirement, d’aligner les cellules perpendiculairement au champ électrique, ce qui minimise le gradient de champ électrique dans l’ensemble de la cellule.
La figure 1 montre une description détaillée de la construction et le dispositif utilisé pour la stimulation. Construire les PDMS et caractéristiques sont optimisés pour une cellule qui s’étend (Figure 1 a, B). Le stimulateur est développé et validé pour l’application effective de la stimulation électrique et mécanique souhaitée aux cellules attaché à la construction PDMS. Ce processus vise à assurer le bon fonctionnement connectivité et utilisateur par le biais de l’interface du logiciel (Figure 1, D).
La procédure pour la stimulation des cellules à l’aide de ce dispositif sur mesure est décrite dans la section protocole.
Protocol
Representative Results
Discussion
La stimulation électromécanique semble être une alternative sûre pour préparer des cellules pour un environnement hostile cardiaque et renforcer leur engagement cardiaque. Ici, un protocole décrit pour cellules souches cardiaques a augmenté l’expression de marqueurs cardiaques principales et a été rapporté pour être bénéfique pour leur prochaine implantation le myocarde murin infarci30. En général, électromécanique stimulées ATDPCs cardiaques a augmenté l’expression de gène…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier les membres du programme de recherche établissement (Mechanism, Badalona) et électroniques et de groupe d’Instrumentation biomédicale (UPC, Barcelone), particulièrement Prof. J. Rosell-Ferrer. En outre, les auteurs reconnaissent cellules souches Translational Medicine journal et presse AlphaMed pour permettre l’adaptation des chiffres précédemment publiés (Llucià-Valldeperas, et al. 30). le développement de ce prototype et la conception du protocole ont été pris en charge par Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), la Commission européenne 7e Programme-cadre () RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), fondation La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502) et Fundación para la Salud Innovación y la Prospectiva fr España (FIPSE ; 00001396-06-15).
Materials
| Stimulator | |||
| nickel plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-10-10-05-N | |
| nickel-plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-06-04-02-HN | |
| polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corp | 184 | |
| ruled diffraction grating (1250 grooves/mm) | Newport | 05RG150-1250-2 | |
| Motor controller | Faulhaber | MCLM-3006-S | |
| Labview | National Instruments | ||
| Cell culture | |||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-065 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-120 | |
| 35 mm cell culture dish | BD Falcon | 45353001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100x | Gibco | 25030-024 | |
| Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Minimum essential medium eagle (alfa-MEM) | Sigma | M4526-24x500ML | |
| Protein & RNA analyses | |||
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | |
| AllPrep RNA/Protein Kit | Qiagen | 50980404 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 172-5140 | |
| Random hexamers | Qiagen | 79236 | |
| TaqMan PreAmp MasterMix 2X | Applied Biosystems | 4391128 | |
| TaqMan Universal PCR MasterMix | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Immunostaining | |||
| 10% formalin | Sigma | HT-501128-4L | |
| horse serum | Sigma | H1138 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Bovine Serum Albumina (BSA) | Sigma | A7906-100G | |
| PARAFILM | Sigma | P6543 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Phalloidin Alexa 568 | Invitrogen | A12380 | |
| sodium azide | Sigma | S8032-100g | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| Connexin-43 rabbit primary antibody | Sigma | C6219 lot#061M4823 | |
| sarcomeric α-actinin mouse primary antibody | Sigma | A7811 lot#080M4864 | |
| GATA-4 goat primary antibody | R&D | AF2606 VAZ0515101 | |
| MEF2 rabbit primary antibody | Santa Cruz | sc-313 lot#E0611 | |
| SERCA2 goat primary antibody | Santa Cruz | sc-8095 lot#D2709 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-165-151 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 712-165-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-225-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-225-147 |
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