Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Aida Lluci&#224;-Valldeperas; Ramon Brag&#243;s; Antoni Bay&#233;s-Gen&#237;s

doi:10.3791/58934

JoVE Journal > Bioengineering

Bioengineering

Estimulação simultânea de elétrica e mecânica para aumentar o potencial de Cardiomyogenic das células

Published: January 18, 2019

doi:

10.3791/58934

Aida Llucià-Valldeperas², Ramon Bragós, Antoni Bayés-Genís^4,5,6

¹Insuficiencia Cardiaca y Regeneración Cardiaca (ICREC) Research Program,Health Science Research Institute Germans Trias i Pujol, ²Amsterdam Universitair Medisch Centrum (UMC), Vrije Universiteit Amsterdam, Pulmonology and Physiology,Amsterdam Cardiovascular Sciences, ³Electronic and Biomedical Instrumentation Group, Departament d’Enginyeria Electrònica,Universitat Politècnica de Catalunya, ⁴Cardiology Service,Germans Trias i Pujol University Hospital, ⁵Department of Medicine,Universitat Autònoma de Barcelona, ⁶Centro de Investigación Biomédica en Red (CIBER) Cardiovascular,Instituto de Salud Carlos III

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo para a formação de uma população celular usando estímulos elétricos e mecânicos, emulando a fisiologia cardíaca. Esta estimulação eletromecânica aumenta o potencial de cardiomyogenic das células tratadas e é uma estratégia promissora para mais terapia celular, modelagem de doença e despistagem de drogas.

Abstract

Doenças cardiovasculares são a principal causa de morte nos países desenvolvidos. Consequentemente, a procura de terapias com células cardíacas eficaz tem motivado pesquisadores nos campos da bioengenharia e células-tronco para desenvolver em vitro alta fidelidade humana miocárdio para investigação fundamental e aplicações clínicas. No entanto, o fenótipo imaturo de células cardíacas é uma limitação na obtenção de tecidos que imitam funcionalmente o miocárdio adulto, que se caracteriza principalmente por sinais mecânicos e elétricos. Assim, o propósito do presente protocolo é preparar e amadurecer o populacao de celula alvo através da estimulação de Eletromecânica, recapitulando parâmetros fisiológicos. Engenharia de tecido cardíaco está evoluindo em direção a abordagens mais biológicas e estratégias baseadas em estímulos biofísicos, assim, estão ganhando impulso. O dispositivo desenvolvido para esta finalidade é único e permite individual ou simultânea elétrica e mecânica estimulação, cuidadosamente caracterizada e validado. Além disso, embora a metodologia foi otimizada para este estimulador e uma população de células específicas, facilmente pode ser adaptado para outros dispositivos e linhas celulares. Os resultados aqui oferecem evidências do compromisso cardíaco aumento da população celular após estimulação eletromecânica. Industrial estimulado as células apresentam um aumento da expressão de marcadores cardíacos principais, incluindo início, estruturais e cálcio-regulação de genes. Este condicionamento celular poderia ser útil para mais longe da terapia com células regenerativas, modelagem de doença e triagem de drogas de alto rendimento.

Introduction

Função do coração é baseada no acoplamento da excitação elétrica e a contração mecânica. Brevemente, junções intercelulares casos permitem a propagação do sinal elétrico para produzir quase síncronas contrações do coração bombear o sangue sistemicamente e através do sistema pulmonar. Células cardíacas, assim, passam por forças elétricas e mecânicas que regulam a função celular e a expressão dos genes. Nesse sentido, muitos grupos têm tentado desenvolver plataformas de cultura que imitam o ambiente fisiológico cardíaco para compreender o papel da estimulação mecânica e elétrica em desenvolvimento cardíaco, função e maturação. Em vitro estímulos elétricos e mecânicos individualmente foram aplicados extensivamente em engenharia de tecido cardíaco para melhorar propriedades funcionais, aumentar a maturação celular ou melhorar o acoplamento de célula-célula e cálcio manipulação¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁰ ^, ²¹. no entanto, condicionado eletromecânico síncrono permanece inexplorado devido o desafio de desenvolver um estimulador e protocolo e devido a otimização obrigatório²².

Trabalho preliminar dirigida estimulação eletromecânica como uma combinação de estimulação elétrica e perfusão de mídia; no entanto, o fluxo não envolve a deformação baseados em tensão típica de enchimento ventricular²³^,²⁴^,²⁵. Mais tarde, abordagens mais fisiológicas combinados estímulos elétricos com deformação física ou estiramento para imitar o tempo contração²⁶^,,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰ ^,³¹. Feng et al. descreveram a primeira demonstração de estimulação Eletromecânica em 2005, comunicação aprimorada casos propriedades contráteis e tamanho²⁶. Wang et al. pré-tratados com células-tronco mesenquimais com 5 azacytidine e aplicado simultâneo condicionado elétrico e mecânico, melhorando recellularization, viabilidade celular, diferenciação cardíaca e tecido remodelação²⁷. Desde aquelas publicações, mais grupos têm relatado na estimulação eletromecânica de monocamadas de células ou engenharia de tecidos (por exemplo, preto²⁸,²⁹^,de Vunjak-Novakovic³¹e nosso grupo³⁰) com o primeiras células condicionadas testaram in vivo³⁰. Brevemente, Morgan e preto testaram várias combinações de estímulos elétricos e mecânicos, relatando que o sincronismo entre estímulos foi crucial porque atrasada combinada eletromecânica estimulação rendeu os melhores resultados de²⁸. Em seguida, Godier-Furnémont e colaboradores otimizado um protocolo de estimulação Eletromecânica para construções de músculo coração engenharia de células de coração de rato neonatal e alcançado, pela primeira vez, uma relação de força positiva-frequência²⁹. Depois disso, nosso grupo relatou que células precondicionadas industrial aumentaram a expressão de marcadores cardíacos principais em vitro e ampla benéfica efeitos in vivo, tais como melhorar a função cardíaca ou aumentou a densidade do navio no infarto região de fronteira³⁰. A publicação mais recente demonstrou que os tecidos cardíacos de haste-pilha-derivado cardiomyocytes sujeitos a eletromecânico condicionado alcançado uma maturação nível mais próximo ao ser humano adulto cardíaca estrutura e função de³¹. Além disso, plataformas alternativas estimulação tridimensional compreendem eletroativos andaimes que fornecem elétrico, mecânico, e topográficas pistas para as células anexado³². Além disso, a deformação mecânica (célula monocamada alongamento e compressão) pode também ser induzida com eletrodos stretchable, simulando as condições fisiológicas normais, bem como condições extremas³³.

Portanto, a lógica é que estímulos eletromecânicos in-vitro, com base em condições fisiológicas poderiam aumentar o potencial de cardiomyogenic de uma célula. Na verdade, este estímulo poderia beneficiar ainda mais integrações de células terapêuticas para o miocárdio em um cenário clínico ou aumentar a maturação do tecido para aplicações de despistagem de drogas.

Além disso, estamos isolados e caracteriza-se uma população de células progenitoras derivadas de tecido adiposo humano de cardíaco de origem (ATDPCs cardíacas)³⁴. Estas células estão localizadas na gordura Epicárdica. Estas células exibir efeitos benéficos de histopatológicos e funcionais no tratamento de infarto do miocárdio e também mantenham a diferenciação cardíaca e endotelial potenciais. ³⁰ ^, ³⁵. formulamos a hipótese que estes benefícios aumentaria após estimulação Biofísica.

Consequentemente, desenvolvemos um dispositivo e um regime de estimulação para a população de células de interesse e investigou os efeitos. Este protocolo eletromecânico é uma nova estratégia para induzir a célula ativa, estendendo-se de forma estéril e canaliza em comparação com anteriores Publicações³⁶, em combinação com a estimulação do campo elétrico. A técnica aqui relatada explica em detalhe o dispositivo e o método utilizado para a estimulação elétrica, mecânica e eletromecânica de células.

Este dispositivo pode fornecer estimulação elétrica e mecânica, isoladamente ou em simultâneo. A estimulação é realizada com uma abordagem de romance não-invasiva e asséptica que inclui suporte a célula presterilized, eletrodos colocados dentro de uma placa de cultura padrão e uma plataforma que induz as forças mecânicas e elétricas (Figura 1).

A plataforma pode conter até seis cultura placas e consiste de uma estrutura de sanduíche de poly(methyl methacrylate) cortados a laser e peças de placa de circuito impresso. O protótipo de plataforma se baseia em uma combinação de um monofásico programáveis controlados por computador estimulador elétrico, uma placa de circuito impresso para a robusta conexão dos eletrodos e seis 10 x 10 mm x 5 mm niquelado fixo de neodímio ímans colocados perto de um dos lados das placas de cultura. Há também uma barra de alumínio com seis ímãs condução (mesmo modelo) colocado na frente do outro lado das placas de cultura e mudou-se com um servomotor linear. O motor é impulsionado por um controlador do motor, operado através de uma porta RS-232 por software comercial (veja a Tabela de materiais). Através da interface do usuário e estimulador programável, é possível programar a intensidade elétrica e frequência, a duração do pulso, a frequência de estimulação mecânica, seu ciclo de trabalho, o número de pulsos, a amplitude de pulso (excursão do ímã), e a inclinação.

Figura 1 : Estimulador eletromecânica. (A) PDMS construção utilizada para o acondicionamento da célula. (B) desenho de construção de PDMS, incluindo eletrodos e ímãs. (C) detalhe da placa de circuito impresso (plataforma), usada para realizar o condicionamento eletromecânico. Este painel foi modificado de Llucià-vedi et al.³⁰. (D) imagens da estimulação eletromecânica plataforma e usuário interface (computador). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tanto o estimulador e o método para o condicionamento de eletromecânico são totalmente descritos em duas patentes internacionais, WO-2013185818-A1³⁷ e WO-2017125159-A1³⁸.

O silicone biocompatível construções projetadas para fornecer suporte estrutural para as células, eletrodos e ímãs têm sido descritos anteriormente¹⁰^,²¹. Resumidamente, eles consistem de polidimetilsiloxano (PDMS), moldado e curado à temperatura ambiente, com um módulo de Young de 1,3 MPa, perto de níveis fisiológicos. A construção contém um pool de cultura de células em uma área de flexível (10 x 10 x 2 mm), dois slots transversais internas para manter os eletrodos e dois incorporado 6 x 2 mm x 4 mm niquelado os ímãs do neodymium. Os eletrodos são construídos com 0,2 platina fio torcido em torno de uma 2 x 3 mm x 12 mm politetrafluoretileno core bar (21 cm por eletrodo, aproximadamente 23 voltas) e colocados em lados opostos da área flexível para criar um campo elétrico por indução estimulação elétrica. Alongamento mecânico é alcançado através da atração magnética entre ímãs encaixados no suporte e externos ímãs colocados ao lado da placa de cultura e o braço de alumínio em movimento. Desta forma, o suporte do celular pode ser estendido sem quebrar a barreira estéril. Esta abordagem é adequada para uma monocamada de células, mas pode ser adaptada para construções tridimensionais, bem como.

Além disso, um padrão regular poderia ser imprimido onde as células são semeadas, usando uma grade de difração regrada (1.250 grooves/mm). A visualização direta das células cultivadas na construção de PDMS sob brightfield e microscópios fluorescentes é possível devido à sua transparência e 0,5 mm de espessura. No presente caso, a piscina de cultura PDMS tem um padrão de superfície vertical, perpendicular à força de alongamento, para alinhar as células perpendicularmente ao campo elétrico, o que minimiza o gradiente do campo elétrico através da célula.

A Figura 1 mostra uma descrição detalhada da construção e o dispositivo usado para a estimulação. Construir os PDMS e características são otimizadas para celular alongamento (figura 1A, B). O estimulador é desenvolvido e validado para a aplicação efectiva da estimulação elétrica e mecânica desejada para células anexado para a construção PDMS. Este processo inclui garantir boa operabilidade de conectividade e usuário através da interface de software (Figura 1, D).

O procedimento para a estimulação de células usando este dispositivo feito por medida é descrito na seção de protocolo.

Protocol

Este estudo utiliza ATDPCs cardíacos humanos de amostras de pacientes. Seu uso foi aprovado pelo Comitê de ética local, e todos os pacientes deram consentimento informado. O protocolo do estudo está em conformidade com os princípios delineados na declaração de Helsinque. 1. preparações Autoclave de duas pinças, 12 eletrodos platina de PTFE para estimulação elétrica e toalhas de papel, a 121 ° C por 20 min. Esterilize 12 construções sob medidas de PD…

Representative Results

A Figura 2 representa o esquema geral seguido para a estimulação da célula. Brevemente, as células foram semeadas na construção de PDMS e submetidas à estimulação eletromecânica, com uma mudança de mídia realizada duas vezes por semana. Células nonstimulated foram usadas como um controle para o condicionamento eletromecânico. Além disso, nós adicionamos um controle extra para o experimento, e ATDPCs subcutâneas foram usados como um controle p…

Discussion

Estimulação eletromecânica parece ser uma alternativa segura para preparar células para um ambiente hostil e cardíaco e reforçar seu compromisso cardíaco. Aqui, um protocolo descrito para as células progenitoras cardíacas aumentou a expressão de marcadores cardíacos principais e foi relatado para ser benéfico para a sua próxima implantação no miocárdio murino enfartado³⁰. Em geral, industrial estimulados ATDPCs cardíacas aumentaram a expressão de genes relacionados a cedo, estrut…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores querem agradecer aos membros do programa de pesquisa ICREC (IGTP, Badalona) e grupo de instrumentação biomédica (UPC, Barcelona), especialmente Prof J. Rosell-Ferrer e eletrônica. Além disso, os autores reconhecem diário de medicina translacional de células-tronco e AlphaMed Press para permitir a adaptação das figuras previamente publicadas (Llucià-vedi, et al ³⁰). o desenvolvimento deste protótipo e o design do protocolo foram apoiadas pelo Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y competitividade (SAF 2014-59892), a Comissão Europeia 7º programa-quadro ( RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502) e Fundación para la Innovación y la Prospectiva en de Salud en España (FIPSE; 06-00001396-15).

Materials

Stimulator
nickel plated neodymium magnets	Supermagnete	Q-10-10-05-N
nickel-plated neodymium magnets	Supermagnete	Q-06-04-02-HN
polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corp	184
ruled diffraction grating (1250 grooves/mm)	Newport	05RG150-1250-2
Motor controller	Faulhaber	MCLM-3006-S
Labview	National Instruments
Cell culture
phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	70013-065
0.05% trypsin-EDTA	Gibco	25300-120
35 mm cell culture dish	BD Falcon	45353001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10270-106
L-Glutamine 200 mM, 100x	Gibco	25030-024
Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL	Gibco	15140-122
Minimum essential medium eagle (alfa-MEM)	Sigma	M4526-24x500ML
Protein & RNA analyses
protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306
AllPrep RNA/Protein Kit	Qiagen	50980404
Rneasy mini kit	Qiagen	74104
iTaq Universal Probes One-Step Kit	Bio-Rad Laboratories	172-5140
Random hexamers	Qiagen	79236
TaqMan PreAmp MasterMix 2X	Applied Biosystems	4391128
TaqMan Universal PCR MasterMix	Applied Biosystems	4324018
Immunostaining
10% formalin	Sigma	HT-501128-4L
horse serum	Sigma	H1138
Triton X-100	Sigma	X100-500ML
Bovine Serum Albumina (BSA)	Sigma	A7906-100G
PARAFILM	Sigma	P6543
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma	D9542
Phalloidin Alexa 568	Invitrogen	A12380
sodium azide	Sigma	S8032-100g
Hoechst 33342	Sigma	14533
Connexin-43 rabbit primary antibody	Sigma	C6219 lot#061M4823
sarcomeric α-actinin mouse primary antibody	Sigma	A7811 lot#080M4864
GATA-4 goat primary antibody	R&D	AF2606 VAZ0515101
MEF2 rabbit primary antibody	Santa Cruz	sc-313 lot#E0611
SERCA2 goat primary antibody	Santa Cruz	sc-8095 lot#D2709
Cy3 secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	711-165-152
Cy3 secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	715-165-151
Cy3 secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	712-165-150
Cy2 secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	715-225-150
Cy2 secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	711-225-152
Cy2 secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	705-225-147

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Llucià-Valldeperas, A., Bragós, R., Bayés-Genís, A. Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells’ Cardiomyogenic Potential. J. Vis. Exp. (143), e58934, doi:10.3791/58934 (2019).