Simultánea estimulación eléctrica y mecánica para mejorar el potencial de las células cardiomiogenético
Summary
Aquí presentamos un protocolo para la formación de una población celular mediante estímulos eléctricos y mecánicos, emulando la fisiología cardiaca. Esta estimulación electromecánica realza el potencial cardiomiogenético de las células tratadas y es una estrategia prometedora para la terapia celular más, modelado de la enfermedad y drogas.
Abstract
Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en los países desarrollados. En consecuencia, la demanda de terapias de la célula cardiaca eficaz ha motivado a los investigadores en los campos de la bioingeniería y la célula de vástago para desarrollar en vitro alta fidelidad humana miocardio para investigación básica y aplicaciones clínicas. Sin embargo, el fenotipo inmaduro de las células cardiacas es una limitación en la obtención de tejidos que imitan funcionalmente el miocardio adulto, que se caracteriza principalmente por señales mecánicas y eléctricas. Así, el propósito del presente Protocolo es preparar y madurar la población de células blanco a través de la estimulación electromecánica, recapitulando los parámetros fisiológicos. Ingeniería del tejido fino cardiaco está evolucionando hacia enfoques más biológicos y estrategias basadas en estímulos biofísicos, por lo tanto, están ganando impulso. El dispositivo desarrollado para este fin es único y permite individual o simultánea estimulación eléctrica y mecánica, cuidadosamente caracterizados y validado. Además, aunque la metodología ha sido optimizada para este estimulador y una población de células específicas, puede fácilmente ser adaptado a otros dispositivos y líneas celulares. Los resultados aquí ofrecen evidencia del compromiso cardiaco aumento de la población de la célula después de la estimulación electromecánica. Electromecánico estimulado las células muestran un aumento de la expresión de marcadores cardíacos principales, incluyendo genes tempranos, estructurales y regulación de calcio. Este condicionamiento de la célula podría ser útil para seguir la terapia celular regenerativa, enfermedad modelado y detección de drogas de alto rendimiento.
Introduction
La función cardíaca se basa en el acoplamiento de la excitación eléctrica y la contracción mecánica. Brevemente, uniones intercelulares cardiomiocitos permitan de propagación de la señal eléctrica para producir contracciones casi síncronas del corazón bombear sangre sistémica y a través del sistema pulmonar. Células cardíacas, por lo tanto, son sometidos a fuerzas eléctricas y mecánicas que regulan la función celular y expresión génica. Por consiguiente, muchos grupos han tratado de desarrollar plataformas de cultura que imitan el entorno fisiológico cardiaco para entender el papel de la estimulación mecánica y eléctrica en el desarrollo cardiaco, la función y maduración. In vitro los estímulos eléctricos y mecánicos individualmente se han aplicado extensamente en la ingeniería de tejido cardíaco para mejorar propiedades funcionales, aumentar la maduración de la célula o mejorar el acoplamiento de la célula y el calcio manejo1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. sin embargo, acondicionado electromecánico sincrónico sigue sin explotar por el desafío de desarrollar un estimulador y un protocolo y por la optimización obligatorio22.
Trabajo preliminar dirigida electromecánica estimulación como una combinación de estimulación eléctrica y perfusión de los medios de comunicación; sin embargo, el flujo no implica la deformación basada en la cepa típica de relleno ventricular23,24,25. Más tarde, enfoques fisiológicos más combinan estímulos eléctricos con deformación física o estiramiento para imitar la isovolumétrica contracción26,27,28,29,30 ,31. Feng et al describieron la primera demostración de estimulación electromecánica en 2005, informes mejorada cardiomiocitos propiedades contráctiles y el26. Wang et al. pretratada en células madre mesenquimales con 5-azacitidina y aplicadas simultánea acondicionado mecánico y eléctrico, mejorar la recelularización, viabilidad celular, diferenciación cardiaca y remodelación27de tejido. Desde las publicaciones, más grupos informaron sobre estimulación electromecánica de monocapas de células o ingeniería de tejidos (e.g., negro28Vunjak-Novakovic29,31y nuestro grupo30) con el primeras células acondicionadas probaron en vivo30. Brevemente, Morgan y negro probaron varias combinaciones de estímulos eléctricos y mecánicos, que el tiempo entre estímulos era crucial porque retrasada estimulación electromecánica combinada produjo mejores resultados28. A continuación, Furnémont Godier y colaboradores optimización un protocolo de estimulación electromecánicos para ingeniería corazón músculo constructores de células de corazón de rata neonatal y alcanzó, por primera vez, una relación positiva fuerza-frecuencia del29. Después, nuestro grupo reportó que células electromecánico previo aumentaron la expresión de marcadores cardiacos principales en vitro y amplio beneficiosa efectos in vivo, tales como mejora la función cardiaca o mayor densidad de vasos en el infarto frontera región30. La publicación más reciente demostró que los tejidos cardiacos de cardiomiocitos derivados de células madre sometida a acondicionado electromecánica alcanzada una maduración nivel más cercano al ser humano adulto cardiaco estructura y función de31. Además, plataformas alternativas de estímulo tridimensional conforman andamios electroactivos que proporcionan electricidad, mecánica, y señales topográficas a las células Unido32. Por otra parte, deformación mecánica (compresión y estiramiento de monocapa de células) también puede ser inducida con electrodos estirables imitando las condiciones fisiológicas normales, así como condiciones extremas33.
Por lo tanto, el fundamento es que en vitro estímulos electromecánicos basados en condiciones fisiológicas podrían aumentar el potencial cardiomiogenético de una célula. De hecho, esta estimulación podría beneficiarse más integraciones de células terapéuticas en el miocardio en un escenario clínico o aumentar la maduración de tejidos para aplicaciones de detección de drogas.
Además, hemos aislado y caracterizado una población de células progenitoras derivadas de tejido adiposo humano de Cardiaco de origen (ATDPCs cardiacas)34. Estas células se encuentran en la grasa epicárdica. Estas células mostrar efectos histopatológicos y funcionales beneficiosos en el tratamiento del infarto de miocardio y también mantienen cardíaca y endotelial diferenciación potencial. 30 , 35. la hipótesis de que estos beneficios aumentarían tras la estimulación Biofísica.
En consecuencia, hemos desarrollado un dispositivo y un régimen de estímulo para la población de la célula de interés e investigó los efectos. Este protocolo electromecánico es una nueva estrategia para inducir la celda activa que se extiende en forma estéril y no invasor en comparación a anteriores publicaciones36, en combinación con el estímulo del campo eléctrico. La técnica que se divulga aquí explica detalladamente el dispositivo y el método utilizado para la estimulación de células eléctrica, mecánica y electromecánica.
Este dispositivo puede proporcionar estimulación eléctrica y mecánica, independientemente o simultáneamente. La estimulación se realiza con un enfoque novedoso no invasivo y aséptico que incluye soporte para celular preesterilizado, electrodos colocados dentro de una placa de cultivo estándar y una plataforma que induce las fuerzas mecánicas y eléctricas (figura 1).
La plataforma puede sostener hasta cultura seis placas y consiste en una estructura sándwich de poly(methyl methacrylate) laser-corte y piezas de placa de circuito impreso. El prototipo de la plataforma se basa en una combinación de un monofásico programable controlado por ordenador estimulador eléctrico, una placa de circuito impreso para la sólida conexión de los electrodos y seis 10 mm x 10 mm x 5 mm niquelado fijo de neodimio imanes cerca de un lado de las placas de cultura. También hay un bar de aluminio con seis imanes de conducción (mismo modelo) situado frente al otro lado de las placas de cultivo y se movió con un servomotor lineal. El motor es accionado por un regulador del motor, funcionado a través de un puerto RS-232 software comercial (véase la Tabla de materiales). A través de la interfaz de usuario y estimulador programable, es posible programar la duración del pulso y frecuencia, la intensidad eléctrica, la frecuencia de estimulación mecánica, su ciclo de trabajo, el número de pulsos, la amplitud de pulso (excursión de imán), y la pendiente.
Figura 1 : Estimulador electromecánico. (A) PDMS construcción utilizada para el acondicionamiento de la célula. (B) dibujo de la construcción PDMS, incluyendo electrodos e imanes. (C) detalle del tablero del circuito impreso (plataforma) utilizado para realizar el acondicionamiento electromecánico. Este panel ha sido modificado de Llucià Valldeperas et al.30. (D) cuadro de la estimulación electromecánico plataforma e interfaz de usuario (ordenador). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El estimulador y el método para acondicionamiento electromecánico se describen completamente en dos patentes internacionales, WO-2013185818-A137 y38de WO-2017125159-A1.
La silicona biocompatible diseñadas para proporcionar apoyo estructural a las células, electrodos e imanes de construcciones han sido descritos10,21. Brevemente, se componen de polidimetilsiloxano (PDMS), moldeado y curado a temperatura ambiente, con módulo de Young de 1,3 MPa, cerca de los niveles fisiológicos. La construcción contiene una piscina de la cultura de célula en una zona flexible (10 x 10 x 2 mm), dos ranuras transversales interiores para sujetar los electrodos y dos integrado 6 mm x 2 mm x 4 imanes de neodimio mm niquelado. Los electrodos se construyen con 0.2 mm platino alambre trenzado alrededor de un 2 x 3 mm x 12 politetrafluoroetileno mm (PTFE) de la base de la barra (21 cm por electrodo, aproximadamente 23 vueltas) y colocados en lados opuestos de la zona flexible para crear un campo eléctrico para inducir estimulación eléctrica. Estiramiento mecánico se logra a través de la atracción magnética entre imanes incrustados en el apoyo e imanes externos junto a la placa de cultivo y en el brazo de aluminio móviles. De esta manera, el apoyo de la célula puede ser extendido sin romper la barrera estéril. Este enfoque es adecuado para una monocapa de células pero podría adaptarse a construcciones tridimensionales, así.
Además, un patrón regular podría ser impreso donde se siembran las células, utilizando una rejilla de difracción gobernada (1.250 surcos/mm). La visualización directa de las células cultivadas en el constructo PDMS bajo brightfield y microscopios fluorescentes es posible debido a su transparencia y 0,5 mm de espesor. En el caso actual, la piscina de la cultura PDMS tiene un patrón superficial vertical, perpendicular a la fuerza que estira, alinear las células perpendicular al campo eléctrico, que minimiza el gradiente de campo eléctrico a través de la célula.
La figura 1 muestra una descripción detallada de la construcción y el dispositivo utilizado para la estimulación. Construir el PDMS y características optimizadas para el estiramiento (figura 1A, B) de la célula. El estimulador es desarrollado y validado para la aplicación efectiva de la deseada estimulación eléctrica y mecánica a las células a la construcción PDMS. Este proceso incluye asegurar buena conectividad y usuario operabilidad a través de la interfaz de software (figura 1, D).
El procedimiento para la estimulación de la célula utilizando este dispositivo a la medida se describe en la sección de protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estimulación electromecánica parece ser una alternativa segura para preparar las células para un hostil ambiente cardiaco y aumentar su compromiso cardiaco. Aquí, un protocolo descrito para las células cardiacas progenitoras aumentó la expresión de marcadores cardiacos principal y fue divulgado para ser beneficioso para su próxima implantación en aquejada de un infarto de miocardio murino30. En general, ATDPCs cardiacos electromecánico estimulados aumentaron la expresión de genes relaci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren agradecer a los miembros del programa de investigación ICREC (vocal, Badalona) y la electrónica y el grupo de instrumentación biomédica (UPC, Barcelona), especialmente el Prof. J. Rosell-Ferrer. Además, los autores reconocen células Translational Medicine journal y AlphaMed Press para permitir la adaptación de figuras previamente publicados (Llucià-Valldeperas, et al. 30). el desarrollo de este prototipo y el diseño del protocolo fueron apoyados por el Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), la Comisión Europea (programa marco 7 RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330 201516, 201502) y Fundación para la Innovación y la Prospectiva en Salud en España (FIPSE; 00001396-06-15).
Materials
| Stimulator | |||
| nickel plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-10-10-05-N | |
| nickel-plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-06-04-02-HN | |
| polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corp | 184 | |
| ruled diffraction grating (1250 grooves/mm) | Newport | 05RG150-1250-2 | |
| Motor controller | Faulhaber | MCLM-3006-S | |
| Labview | National Instruments | ||
| Cell culture | |||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-065 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-120 | |
| 35 mm cell culture dish | BD Falcon | 45353001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100x | Gibco | 25030-024 | |
| Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Minimum essential medium eagle (alfa-MEM) | Sigma | M4526-24x500ML | |
| Protein & RNA analyses | |||
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | |
| AllPrep RNA/Protein Kit | Qiagen | 50980404 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 172-5140 | |
| Random hexamers | Qiagen | 79236 | |
| TaqMan PreAmp MasterMix 2X | Applied Biosystems | 4391128 | |
| TaqMan Universal PCR MasterMix | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Immunostaining | |||
| 10% formalin | Sigma | HT-501128-4L | |
| horse serum | Sigma | H1138 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Bovine Serum Albumina (BSA) | Sigma | A7906-100G | |
| PARAFILM | Sigma | P6543 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Phalloidin Alexa 568 | Invitrogen | A12380 | |
| sodium azide | Sigma | S8032-100g | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| Connexin-43 rabbit primary antibody | Sigma | C6219 lot#061M4823 | |
| sarcomeric α-actinin mouse primary antibody | Sigma | A7811 lot#080M4864 | |
| GATA-4 goat primary antibody | R&D | AF2606 VAZ0515101 | |
| MEF2 rabbit primary antibody | Santa Cruz | sc-313 lot#E0611 | |
| SERCA2 goat primary antibody | Santa Cruz | sc-8095 lot#D2709 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-165-151 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 712-165-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-225-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-225-147 |
References
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