Simultanea stimolazione elettrica e meccanica per migliorare il potenziale di cardiomiogenici delle cellule
Summary
Qui presentiamo un protocollo per la formazione di una popolazione delle cellule usando stimoli elettrici e meccanici, emulando la fisiologia cardiaca. Questa stimolazione elettromeccanica migliora il potenziale di cardiomiogenici delle cellule trattate ed è una strategia promettente per ulteriore terapia cellulare, la modellazione di malattia e lo screening di stupefacenti.
Abstract
Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte nei paesi sviluppati. Di conseguenza, la domanda di terapie efficaci cellula cardiaca ha motivato i ricercatori nei campi di Bioingegneria e cellule staminali a sviluppare in vitro ad alta fedeltà miocardio umano per la ricerca di base e applicazioni cliniche. Tuttavia, il fenotipo immaturo delle cellule cardiache è una limitazione sull’ottenere tessuti che imitano funzionalmente il miocardio adulto, che è principalmente caratterizzato da segnali meccanici ed elettrici. Così, lo scopo del presente protocollo è di preparare e maturare la popolazione delle cellule di destinazione attraverso la stimolazione elettromeccanica, ricapitolare i parametri fisiologici. Ingegneria del tessuto cardiaco si sta evolvendo verso approcci più biologici e strategie basate sugli stimoli biofisici, così, stanno guadagnando slancio. Il dispositivo sviluppato per questo scopo è unico e permette individuo o simultanea stimolazione elettrica e meccanica, accuratamente caratterizzata e convalidato. Inoltre, anche se la metodologia è stata ottimizzata per questo stimolatore e una popolazione di cellule specifiche, può facilmente essere adattato ad altri dispositivi e linee cellulari. Qui i risultati offrono la prova dell’impegno cardiaco aumentato della popolazione cellulare dopo stimolazione elettromeccanica. Elettromeccanico stimolato le cellule mostrano un incremento dell’espressione dei principali marcatori cardiaci, compreso i geni precoce, strutturali e diregolamento. Questo condizionamento cella potrebbe essere utile per ulteriormente la terapia rigenerativa cellulare, la modellazione di malattia e screening di farmaci di alto-rendimento.
Introduction
Funzione del cuore è basata sull’accoppiamento di eccitazione elettrica e meccanica contrazione. Brevemente, le giunzioni intercellulari del cardiomyocyte permettono di propagazione del segnale elettrico per produrre quasi sincrone contrazioni del cuore quel sangue pompa sistemica e attraverso il sistema polmonare. Le cellule cardiache, subiscono così sia elettriche che meccaniche forze che regolano la funzione cellulare e l’espressione del gene. Di conseguenza, molti gruppi hanno tentato di sviluppare piattaforme di cultura che simulano l’ambiente fisiologico cardiaco per comprendere il ruolo della stimolazione elettrica e meccanica sullo sviluppo cardiaco, la funzione e la maturazione. In vitro stimolazioni elettriche e meccaniche individualmente sono stati applicati estesamente in ingegneria del tessuto cardiaco per migliorare proprietà funzionali, aumentare la maturazione delle cellule o accoppiamento cellula-cellula e calcio manipolazione1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Tuttavia, sincrono condizionata elettromeccanico rimane inutilizzato a causa la sfida di sviluppare un protocollo e stimolatore e per l’ obbligatorio ottimizzazione22.
Lavoro preliminare indirizzata stimolazione elettromeccanica come una combinazione di stimolazione elettrica e l’aspersione di media; Tuttavia, il flusso non comporta la deformazione basati su ceppo tipica del riempimento ventricolare23,24,25. Più tardi, più fisiologici approcci combinati stimoli elettrici con deformazione fisica o tratto di imitare le isovolumetrico contrazione26,27,28,29,30 ,31. Feng et al. descritto la prima dimostrazione di stimolazione elettromeccanica nel 2005, segnalazione migliorata dei cardiomiociti le proprietà size e contrattili26. Wang et al. pretrattato le cellule staminali mesenchimali con 5-azacitidina e applicato simultanea condizionata elettrica e meccanica, migliorare ricellularizzazione, vitalità cellulare, differenziamento cardiaco ed il tessuto che ritocca27. Poiché tali pubblicazioni, altri gruppi hanno segnalato sulla stimolazione elettromeccanica di monostrati di cellule umane o progettato tessuti (ad es., nero28, Vunjak-Novakovic29,31e il nostro gruppo30) con la prime condizionate cellule testate in vivo30. Brevemente, Morgan e nero testato diverse combinazioni di stimoli elettrici e meccanici, segnalare che la tempistica tra stimolazioni era cruciale perché in ritardo stimolazione combinata elettromeccanica ha prodotto i migliori risultati28. Successivamente, Godier-Furnémont e collaboratori ottimizzato un protocollo di stimolazione elettromeccanici per i costrutti di muscolo cardiaco ingegnerizzato da cellule del cuore neonatale del ratto e raggiunto, per la prima volta, un rapporto di forza-frequenza positiva29. In seguito, il nostro gruppo ha riferito che cellule elettromeccanico precondizionate ha aumentato l’espressione di marcatori cardiaci principale in vitro e generica benefica effetti in vivo, come ha migliorato la funzione cardiaca o aumentato la densità del vaso in infarto regione di confine30. La pubblicazione più recente ha dimostrato che i tessuti cardiaci da cardiomiociti derivati da cellule staminali sottoposti a elettromeccanico condizionata ha raggiunto una maturazione livello più vicino all’essere umano adulto cardiaca struttura e funzione31. Inoltre, piattaforme di stimolazione tridimensionale alternativi comprendono elettroattivi impalcature che forniscono elettrici, meccanici e topografiche segnali alle cellule allegato32. Inoltre, la deformazione meccanica (cellulare dello strato monomolecolare stretching e compressione) possa anche essere indotti con elettrodi estensibili che imita condizioni fisiologiche normali, come pure le condizioni estreme33.
Di conseguenza, la logica è che stimoli elettromeccanici in vitro basati su condizioni fisiologiche potrebbero migliorare il potenziale di cardiomiogenici di una cella. Infatti, questa stimolazione potrebbe beneficiare di ulteriori integrazioni di cellule terapeutiche nel miocardio in uno scenario clinico o aumentare la maturazione del tessuto per applicazioni di screening di stupefacenti.
Inoltre, abbiamo isolato e caratterizzato una popolazione di cellule progenitrici derivate dal tessuto adiposo umano di cardiaco di origine (ATDPCs cardiaca)34. Queste cellule si trovano nel grasso dell’epicardio. Queste cellule visualizzare effetti istopatologici e funzionali benefici nel trattamento di infarto miocardico e anche mantengono la differenziazione cardiaca ed endoteliale potenziali. 30 , 35. abbiamo supposto che questi benefici aumenterebbero dopo stimolazione biofisica.
Di conseguenza, abbiamo sviluppato un dispositivo e un regime di stimolazione per la popolazione delle cellule di interesse e studiato gli effetti. Questo protocollo elettromeccanico è una nuova strategia per indurre la cella attiva, che si estende in modo sterile e non invadente rispetto a precedenti pubblicazioni36, in combinazione con la stimolazione del campo elettrico. La tecnica segnalata qui spiega in dettaglio il dispositivo e il metodo utilizzato per la stimolazione elettrica, meccanica ed elettromeccanica delle cellule.
Questo dispositivo può fornire stimolazione sia elettrica che meccanica, singolarmente o contemporaneamente. La stimolazione viene eseguita con un metodo novello non invadente e asettico che include il supporto di cella presterilizzati, elettrodi posizionati all’interno di una piastra di coltura standard e una piattaforma che induce le forze meccaniche ed elettriche (Figura 1).
La piattaforma può contenere fino a sei cultura piastre ed è costituito da una struttura a sandwich del taglio laser poly(methyl methacrylate) e pezzi di bordo del circuito stampato. Il prototipo di piattaforma si basa su una combinazione di una monofasica programmabile computerizzato stimolatore elettrico, scheda a circuiti stampati per la potente connessione degli elettrodi e magneti al neodimio-fisso nichelato sei 10 x 10 mm x 5 mm disposti vicino a un lato delle piastre di coltura. C’è anche una barra di alluminio con sei magneti guida (stesso modello) posta di fronte l’altro lato delle piastre cultura e spostato con un servomotore lineare. Il motore è comandato da un controllore motore, operato attraverso una porta RS-232 da software commerciale (Vedi la Tabella materiali). Attraverso l’interfaccia utente e stimolatore programmabile, è possibile programmare l’intensità elettrica, la durata dell’impulso e frequenza, la frequenza di stimolazione meccanica, ciclo di dovere, il numero di impulsi, l’ampiezza di impulso (escursione magnete), e la pendenza.
Figura 1 : Stimolatore elettromeccanico. (A) PDMS costrutto utilizzato per il condizionamento delle cellule. (B) disegno del costrutto PDMS, compresi elettrodi e magneti. (C) particolare del bordo del circuito stampato (piattaforma) utilizzato per eseguire il condizionamento elettromeccanico. Questo pannello è stato modificato da Llucià-Valldeperas et al.30. (D) foto della stimolazione elettromeccanici piattaforma e l’interfaccia utente (computer). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Lo stimolatore sia il metodo per il condizionamento elettromeccanico sono descritti in due brevetti internazionali, WO-2013185818-A137 e WO-2017125159-A138.
Il silicone biocompatibile costrutti progettati per fornire un sostegno strutturale a cellule, elettrodi e magneti sono stati descritti precedentemente10,21. Brevemente, si tratta di polidimetilsilossano (PDMS), modellato e curato a temperatura ambiente, con un modulo di Young di 1,3 MPa, vicino ai livelli fisiologici. Il costrutto contiene un pool di cultura delle cellule in un’area flessibile (10 x 10 x 2 mm), due slot trasversale interna per tenere gli elettrodi e due incorporato 6 x 2 mm x 4 mm nichelato del neodimio. Gli elettrodi sono costruiti con 0.2 mm platino filo attorcigliato un 2 x 3 mm x 12 di politetrafluoroetilene (PTFE) di mm core (21 cm per elettrodo, circa 23 giri) e collocati ai lati opposti della zona flessibile per creare un campo elettrico per l’induzione stimolazione elettrica. Stiramento meccanico avviene attraverso l’attrazione magnetica tra magneti incorporati nel supporto e magneti esterni collocati accanto la piastra di coltura e sul movimento braccio in alluminio. In questo modo, il supporto di cella può essere esteso senza rompere la barriera sterile. Questo approccio è adatto per un monostrato di cellule ma potrebbe essere adattato ai costrutti tridimensionali, pure.
Inoltre, uno schema regolare potrebbe essere impresso dove le cellule sono seminate, utilizzando un reticolo di diffrazione governato (1.250 scanalature/mm). La visualizzazione diretta delle cellule coltivate sul costrutto di PDMS sotto campo chiaro e microscopi fluorescenti è possibile grazie alla sua trasparenza e 0,5 mm di spessore. Nel caso attuale, la piscina di cultura PDMS ha un modello di superficie verticale, perpendicolare alla forza di stiramento, per allineare le cellule perpendicolarmente al campo elettrico, che minimizza il gradiente di campo elettrico attraverso la cella.
La figura 1 Mostra una descrizione dettagliata del costrutto e del dispositivo utilizzato per la stimolazione. Costruire il PDMS e caratteristiche sono ottimizzate per la cella che si estende (Figura 1A, B). Lo stimolatore è sviluppato e validato per l’efficace applicazione della stimolazione elettrica e meccanica desiderata a cellule allegate al costrutto di PDMS. Questo processo include la garanzia buona operabilità connettività e utente tramite l’interfaccia software (Figura 1, D).
La procedura per la stimolazione di cellule utilizzando questo dispositivo su misura è descritta nella sezione protocollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Elettromeccanica stimolazione sembra essere un’alternativa sicura per preparare le celle per un ambiente ostile cardiaco e rafforzare il loro impegno cardiaco. Qui, un protocollo descritto per cellule progenitrici cardiache aumenta l’espressione di marcatori cardiaci principali ed era segnalato per essere utile per loro prossimo impianto il miocardio infartuato murino30. In generale, ATDPCs cardiaco elettromeccanico stimolato ha aumentato l’espressione di geni correlati a presto, strutturali e reg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare i membri del gruppo Strumentazione Biomedica (UPC, Barcellona), soprattutto prof J. Rosell-Ferrer ed elettronica e il programma di ricerca di ICREC (IGTP, Badalona). Inoltre, gli autori riconoscono le cellule staminali Translational Medicine journal e AlphaMed Press per consentire l’adattamento delle figure precedentemente pubblicati (Llucià-Valldeperas, et al. 30). lo sviluppo di questo prototipo e la progettazione del protocollo sono stati sostenuti dal Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), la Commissione europea 7 ° programma quadro ( RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502) e Fundación para la Innovación y la Prospectiva dell’en Salud España (FIPSE; 06-00001396-15).
Materials
| Stimulator | |||
| nickel plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-10-10-05-N | |
| nickel-plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-06-04-02-HN | |
| polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corp | 184 | |
| ruled diffraction grating (1250 grooves/mm) | Newport | 05RG150-1250-2 | |
| Motor controller | Faulhaber | MCLM-3006-S | |
| Labview | National Instruments | ||
| Cell culture | |||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-065 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-120 | |
| 35 mm cell culture dish | BD Falcon | 45353001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100x | Gibco | 25030-024 | |
| Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Minimum essential medium eagle (alfa-MEM) | Sigma | M4526-24x500ML | |
| Protein & RNA analyses | |||
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | |
| AllPrep RNA/Protein Kit | Qiagen | 50980404 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 172-5140 | |
| Random hexamers | Qiagen | 79236 | |
| TaqMan PreAmp MasterMix 2X | Applied Biosystems | 4391128 | |
| TaqMan Universal PCR MasterMix | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Immunostaining | |||
| 10% formalin | Sigma | HT-501128-4L | |
| horse serum | Sigma | H1138 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Bovine Serum Albumina (BSA) | Sigma | A7906-100G | |
| PARAFILM | Sigma | P6543 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Phalloidin Alexa 568 | Invitrogen | A12380 | |
| sodium azide | Sigma | S8032-100g | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| Connexin-43 rabbit primary antibody | Sigma | C6219 lot#061M4823 | |
| sarcomeric α-actinin mouse primary antibody | Sigma | A7811 lot#080M4864 | |
| GATA-4 goat primary antibody | R&D | AF2606 VAZ0515101 | |
| MEF2 rabbit primary antibody | Santa Cruz | sc-313 lot#E0611 | |
| SERCA2 goat primary antibody | Santa Cruz | sc-8095 lot#D2709 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-165-151 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 712-165-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-225-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-225-147 |
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