Adsorption de spores comme un système d’affichage recombinants pour les Enzymes et les antigènes
Summary
Ce protocole porte sur l’utilisation des spores bactériennes comme un outil de nanobiotechnological « en direct » pour adsorber les molécules hétérologues avec diverses activités biologiques. Les méthodes pour mesurer l’efficacité d’adsorption sont également indiqués.
Abstract
Les spores bactériennes est une cellule métaboliquement quiescente, formée par une série de couches protectrices entourant un cytoplasme déshydraté. Cette structure particulière rend la spore extrêmement stable et résistant et a suggéré l’utilisation de la spore comme une plate-forme pour afficher des molécules hétérologues. Jusqu’ici, une variété d’antigènes et d’enzymes ont été affichés sur les spores de Bacillus subtilis et de quelques autres espèces, tout d’abord par une approche recombinante et, ensuite, par une méthode simple et efficace de recombinants. Le système d’affichage recombinants repose sur l’adsorption directe de hétérologue molécules sur la surface des spores, en évitant la construction de souches recombinantes et la libération des bactéries génétiquement modifiés dans l’environnement. Molécules adsorbées sont stabilisées et protégés par l’interaction avec les spores, qui limite la dégradation rapide des antigènes et la perte de l’activité enzymatique à des conditions défavorables. Une fois utilisé, spore-adsorbé enzymes peuvent être collectées facilement avec une réduction minimale de l’activité et réutilisés pour tours de réaction supplémentaire. Dans le présent document est montré comment s’adsorber les molécules modèles à spores purifiées de b. subtilis, comment évaluer l’efficacité d’adsorption et la collecte des spores usagés pour les recycler pour nouvelles réactions.
Introduction
Systèmes d’affichage visent à présenter des molécules biologiquement actives sur la surface des micro-organismes et de trouver des applications dans une variété de domaines, des industriels aux biotechnologies médicales et écologiques. En plus des phages1,2 et cellules de divers Gram – positifs et espèces3,4,5,6,7, spores bactériennes ont également été proposé comme systèmes d’affichage par deux approches8,9.
En raison de sa structure particulière, à savoir un cytoplasme déshydraté, entouré par une série de couches protectrices10, la spore offre plusieurs avantages par rapport aux phages et cellule dotés d’écran systèmes8,9. Un premier avantage provient de l’extrême robustesse et stabilité des spores dans des conditions qui seraient préjudiciables à tous les autres cellules10,11. Enzymes et spore-affiche les antigènes sont stables après une conservation à température ambiante12 et protégée de la dégradation à pH faible et des températures élevées,13. Un deuxième avantage des spores est la sécurité de nombreuses espèces sporulées. B. subtilis, b. clausii, b. coagulanset plusieurs autres espèces sont utilisées dans le monde entier comme probiotiques et sont trouvent sur le marché à usage humain ou animal pour des décennies14,15. Cet enregistrement de sécurité exceptionnel est une évidente exigence générale pour un système d’affichage de surface et est particulièrement pertinent lorsque le système est destiné à l’usage humain ou animal,16. Un tiers, un avantage important d’un système d’affichage basé sur spore est qu’il n’a pas de limites pour la taille de la molécule qui doit être exposé. Dans les systèmes phage, une grosse protéine hétérologue peut affecter la structure de la capside, tandis que dans les systèmes basés sur les cellules, il peut affecter la structure de la membrane ou limite/qui risqueraient de la membrane translocation étape17. Les couches protectrices entourant la spore sont composent de plus de 70 différents protéines10 et sont suffisamment souples pour accepter les grosses protéines étrangères sans défaut structurel évident ou une impotence fonctionnelle8. En outre, avec les deux systèmes d’affichage axée sur les spores, la translocation de la membrane de la protéine hétérologue n’est pas requis8,9. En effet, les protéines hétérologues sont soit produites dans le cytoplasme de la cellule-mère et assemblés sur le spore qui se forme dans le même cytoplasme ou adsorbés sur les spores mûres8,9.
Affichage de spore a été initialement obtenu en développant un système génétique pour l’ingénieur de la spore surface18. Ce système génétique reposait sur i) la construction d’une fusion de gènes entre le gène codant pour une protéine de capside de spore (utilisée comme support) et le gène codant pour la protéine d’être affiché – la présence des signaux transcription et traduction de l’endogène gène contrôlera l’expression de la fusion et ii) l’intégration du gène sur le chromosome de b. subtilis d’accorder la stabilité génétique chimérique. Une variété d’antigènes et d’enzymes ont été affichées par cette approche recombinante, à l’aide de diverses protéines de surface des spores comme porteurs et visant à diverses applications possibles, allant de vaccin muqueux à biocatalyseur, biocapteurs, bioremédiation, ou bioanalytiques outil8,13.
Plus récemment, une approche différente de l’affichage de la spore a été développé19. Ce deuxième système est recombinants et repose sur l’adsorption spontanée et extrêmement serrée des molécules sur la surface de spore9. 19,d’antigènes20 et enzymes de13,21 ont été exposés avec efficacité et ont révélé que cette méthode est significativement plus efficace que celui recombinant. Cette approche non permet l’affichage des protéines dans la forme native20 et peut également être utilisée avec autoclave, mort des spores19. Le mécanisme moléculaire de l’adsorption n’a pas été entièrement précisé encore. La charge négative et l’hydrophobicité de la spore ont été proposés en tant que propriétés pertinentes pour l’adsorption13,19,22. Récemment, il a été démontré qu’une protéine de modèle, la protéine auto-fluorescente rouge (RDRF) des coraux Acropora, lorsque adsorbés à la spore, a pu s’infiltrer à travers les couches de surface localisation dans la couche intérieure de23. S’est avéré vrai pour les autres protéines, la localisation interne des protéines hétérologues pourrait expliquer leur stabilité accrue lorsque adsorbé à spores23.
Dans une étude récente, deux enzymes catalysant deux étapes successives de la voie de dégradation de xylan s’affichaient indépendamment sur les spores de b. subtilis et incubés ensemble, ont été en mesure d’effectuer les deux étapes de dégradation21. Spores recueillis après la réaction étaient encore actifs et en mesure de continuer la dégradation xylane lors de l’addition du substrat frais21. Même si une perte d’environ 15 % du produit final a été observée dans la deuxième réaction21, la réutilisabilité des enzymes adsorbés pour unique, ainsi que plusieurs étapes, les réactions constitue un atout important du système d’affichage de la spore.
Pan et al.24 a signalé une approche supplémentaire pour afficher des protéines hétérologues sur la surface des spores : protéines hétérologues (une protéine endoglucanase et une bêta-galactosidase un) produits dans la cellule-mère au cours de la sporulation étaient spontanément enfermé dans le manteau formant des spores, sans avoir besoin d’un transporteur. Ce système d’affichage supplémentaires spore est une combinaison des deux approches décrites jusqu’à présent. En effet, il est recombinant puisque les protéines hétérologues ont été conçus pour être exprimé dans la cellule-mère au cours de la sporulation, tandis que leur Assemblée au sein de la couche a été spontanée et, par conséquent, non24. Cependant, l’efficacité de l’affichage de cette approche supplémentaire reste à être testés et comparés avec les deux autres approches en utilisant les mêmes protéines hétérologues.
Le présent protocole exclut les processus de production de spores et de purification, qui ont été décrits abondamment ailleurs24. Il comprend la réaction d’adsorption, l’évaluation de l’efficacité d’adsorption par microscopie-dot-blot et de fluorescence, et le recyclage des enzymes adsorbés de réaction supplémentaire de tours.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole d’adsorption de spore est très simple et intuitive. La réaction est strictement dépendante du pH de la mémoire tampon de réaction et l’efficacité d’adsorption est optimale lorsque le pH acide (pH 5,0 ou plus bas). À des conditions de pH neutre, l’efficacité d’adsorption est faible, et à un pH alcalin, adsorption ne peut survenir. Adsorption optimale est obtenue en utilisant un volume de 200 µL dans des tubes de 1,5 mL (ou garder un ratio similaire) sur un agitateur basculant.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par « Finanziamento di Ricerca di Ateneo » à L. Baccigalupi, titre du projet « SP-LAY : des spores bactériennes platefrome direct pour l’affichage des protéines ».
Materials
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
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