作为酶和抗原的非重组显示系统的孢子吸附
Summary
该议定书的重点是利用细菌孢子作为 “活” 纳米生物技术工具来吸附具有各种生物活性的异源分子。并给出了测定吸附效率的方法。
Abstract
细菌孢子是一种代谢静止的细胞, 由一系列保护层围绕脱水的细胞质形成。这种特殊的结构使孢子极其稳定和耐药, 并建议使用孢子作为显示异源分子的平台。到目前为止, 在枯草芽孢杆菌和其他几种物种的孢子上都显示了各种抗原和酶, 最初是用重组方法, 然后是用一种简单有效的非重组方法。非重组显示系统是基于在孢子表面直接吸附异源分子, 避免了重组菌株的构建和转基因细菌在环境中的释放。吸附分子通过与孢子的相互作用得到稳定和保护, 从而限制了抗原的快速降解和酶活性在不利条件下的丧失。一旦使用, 孢子吸附酶可以很容易地收集与最小的活性减少和再利用额外的反应轮。本文介绍了如何吸附模型分子对枯草芽孢的纯化, 如何评价吸附效率, 以及如何收集使用过的孢子进行回收, 以获得新的反应。
Introduction
显示系统旨在在微生物表面呈现生物活性分子, 并在从工业到医疗和环境生物技术等多个领域寻找应用。除了噬菌体1,2和细胞的各种革兰氏阴性和阳性物种3,4,5, 6, 7, 细菌孢子也已提出作为显示系统的两个方法8,9。
由于其特殊的结构, 即脱水的细胞质包围了一系列保护层10,孢子提供了几个优势, 比基于噬体和细胞为基础的显示系统8,9。第一个优势来自孢子在对所有其他细胞 10、11 有害的条件下的极端鲁棒性和稳定性。在室温12下长时间储存后, 显示酶的抗原和酶是稳定的, 在低 ph 值和高温度13下防止降解。孢子的第二个优点是许多孢子形成物种的安全性。b. 枯草、b. clausii、b. 凝血和其他几个物种在世界各地被用作益生菌, 并已在人类或动物市场上销售了14、15.这种特殊的安全记录是表面显示系统的一个明显的一般要求, 在该系统用于人类或动物时尤其重要.基于孢子的显示系统的第三个重要优点是, 它对必须暴露的分子的大小没有限制。在基于噬体的系统中, 大型异源蛋白可能会影响衣壳的结构, 而在细胞基系统中, 可能会影响膜的结构, 或可能会限制/损害膜的移位步骤17。孢子周围的保护层由70多个不同的蛋白质10 组成, 具有足够的灵活性, 可以接受大的外来蛋白质, 而不会出现任何明显的结构缺陷或功能障碍8。此外, 在两种基于孢子的显示系统中, 不需要异源蛋白的膜移位 8,9。事实上, 异源蛋白要么在母细胞细胞质中产生, 并聚集在在同一细胞质中形成的孢子上, 要么吸附在成熟的孢子8,9上。
孢子显示最初是通过开发一个基因工程系统来设计孢子表面 18。这个基因系统是基于 i) 在基因编码为孢子涂层蛋白质 (用作载体) 和基因编码之间的结构在被显示的蛋白质-的存在转录和翻译信号的内源性基因将控制融合的表达, ii) 在b.枯草染色体上整合嵌合基因, 以获得遗传稳定性。这种重组方法显示了各种抗原和酶, 使用各种孢子表面蛋白作为载体, 并针对各种潜在的应用, 从黏膜疫苗到生物催化剂、生物传感器、生物修复, 或生物分析工具8,13。
最近, 开发了一种不同的孢子显示方法.这第二个系统是非重组的, 依赖于分子在孢子表面9上的自发和极其紧密的吸附。抗原19、20和酶13、21已有效显示, 该方法明显高于重组方法。这种非重组方法允许以原生形式20显示蛋白质, 也可与蒸压、死亡孢子19 一起使用。吸附的分子机制尚未得到充分的澄清。提出了孢子的负电荷和疏水性, 作为与吸附13、19、22 有关的特性。最近, 研究表明, 珊瑚瘤的一种模型蛋白, 即红色自荧光蛋白 (mrfp), 吸附在孢子中, 能够通过内涂层中的表面层渗透 23.如果证明其他蛋白质是正确的, 异源蛋白的内部定位可以解释它们在吸附到孢子 23时更高的稳定性。
在最近的一项研究中, 两种催化木兰降解途径连续两个步骤的酶在枯草芽孢杆菌孢子上独立显示, 当一起孵育时, 能够同时完成这两个降解步骤21。反应后收集的孢子仍然活跃, 能够在添加新鲜底物21后继续木兰降解。即使在第二反应21中观察到最终产物约15% 的损失, 单次吸附酶的可重用性以及多步骤的反应也是孢子显示系统的另一个重要优势。
Pan 等人报告了在孢子表面显示异源蛋白的另一种方法: 在孢子过程中, 母细胞产生的异源蛋白 (一种内聚糖酶蛋白和β-半乳糖苷酶) 是自发产生的包裹在成型的孢子涂层, 不需要载体。这种额外的孢子显示系统是迄今为止所描述的两种方法的组合。事实上, 它是重组的, 因为异源蛋白被设计成在孢子过程中在母细胞中表达, 而它们在涂层中的组装是自发的, 因此, 非重组 24.然而, 这种附加方法的显示效率仍有待测试, 并通过使用相同的异源蛋白与其他两种方法进行比较。
本议定书不包括孢子的生产和净化过程, 其他地方对这些过程作了广泛的描述。它包括吸附反应、点印迹和荧光显微镜对吸附效率的评价, 以及吸附酶对其他反应轮的回收利用。
Protocol
Representative Results
Discussion
这种孢子吸附协议非常简单和直接。反应严格取决于反应缓冲液的 pH 值, 在酸性 ph 值 (pH 值5.0 或更低) 下, 吸附效率最佳。在中性 pH 条件下, 吸附效率较低, 在碱性 pH 值下, 可能不会发生吸附。在摇摆机上使用 1.5 Ml 管中的200μl 体积 (或保持相似的比例) 获得最佳吸附。
吸附非常紧密, 在相同的反应缓冲液 ph 值下使用缓冲液清洗不会导致吸附蛋白的任何释放。使用碱性缓冲液清…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 “Finanziamento di Ricerca di Ateneo” 至 L. Baccigalupi 的支持, 项目标题为 “SP-LAY: 细菌孢子作为蛋白质显示的活平台”。
Materials
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
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