Spore-Adsorption als ein Nonrecombinant Display-System für Enzyme und Antigene
Summary
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung von Bakteriensporen als “live” nanobiotechnologische Werkzeug zu adsorbieren, heterologe Moleküle mit verschiedenen biologischen Aktivitäten. Die Methoden zur Messung der Effizienz der Adsorption werden ebenfalls angezeigt.
Abstract
Die bakterielle Spore ist ein metabolisch ruhenden Zelle, durch eine Reihe von Schutzschichten, die rund um eine dehydrierte Zytoplasma gebildet. Diese eigenartige Struktur macht die Spore, extrem stabil und widerstandsfähig und hat vorgeschlagen, die Verwendung von der Spore als Plattform zur heterologen Moleküle anzuzeigen. So weit, eine Vielzahl von Antigenen und Enzyme angezeigt worden auf Sporen von Bacillus Subtilis und ein paar andere Arten zunächst durch einen rekombinanten Ansatz und dann durch eine einfache und effiziente Methode, nonrecombinant. Nonrecombinant Display-System basiert auf der direkten Adsorption von heterologen Moleküle auf der Oberfläche von Spore, den Bau von rekombinanten Stämme und die Freisetzung von gentechnisch veränderten Bakterien in der Umwelt zu vermeiden. Adsorbierten Moleküle sind stabilisiert und geschützt durch die Interaktion mit Sporen, die den raschen Abbau von Antigenen und den Verlust der Enzymaktivität bei ungünstigen Bedingungen begrenzt. Wenn, können für zusätzliche Reaktion runden Spore adsorbiert Enzyme leicht mit einer minimalen Reduktion der Aktivität gesammelt und wiederverwendet werden. In diesem Papier wird gezeigt, wie zu adsorbieren, Modell Moleküle an gereinigten Sporen von B. Subtilis, wie die Effizienz der Adsorption bewerten und sammeln von gebrauchten Sporen um sie für neue Reaktionen zu recyceln.
Introduction
Display-Systeme sollen biologisch aktive Molekülen auf der Oberfläche von Mikroorganismen zu präsentieren und finden Anwendungen in den unterschiedlichsten Bereichen von Industrie, Medizin- und Umwelttechnik Biotechnologien. Neben Phagen1,2 und Zellen von verschiedenen gram-positive Art3,4,5,6,7, wurden ebenfalls Bakteriensporen als Display-Systeme von zwei Ansätze8,9vorgeschlagen.
Wegen seiner besonderen Struktur, nämlich eine dehydrierte Zytoplasma umgeben von einer Reihe von Schutzschichten10, bietet die Spore mehrere Vorteile gegenüber Phagen und zellbasierte Display Systeme8,9. Ein erste Vorteil ist die extreme Robustheit und Stabilität der Sporen zu Konditionen, die für alle anderen Zellen10,11schädlich wäre. Spore-Anzeige Antigene und Enzyme sind stabil, nach längerer Lagerung bei Raumtemperatur12 und vor Abbau bei niedrigem pH-Wert und hohen Temperaturen13 geschützt. Ein zweiter Vorteil der Sporen ist die Sicherheit vieler Spore-bildenden Arten. B. Coagulans, B. Subtilis, B. Clausiiund mehrere andere Arten werden weltweit als Probiotika verwendet und wurden auf dem Markt für den menschlichen oder tierischen Einsatz für Jahrzehnte14,15. Diese außergewöhnliche Sicherheitsbilanz ist eine offensichtliche allgemeine Voraussetzung für ein DGM-Anzeige-System und ist von besonderer Bedeutung, wenn das System für menschlichen oder tierischen Gebrauch16vorgesehen ist. Ein Drittel ist wichtiger Vorteil der eine Spore-basierte Display-System, dass es keinen Beschränkungen für die Größe des Moleküls, die ausgesetzt werden. In Phagen-basierten Systemen eine große heterologen Proteinen beeinträchtigen die Struktur der das Kapsid während in Zell-basierte Systeme, es kann Einfluss auf die Struktur der Membran oder Grenze/beeinträchtigen können die Membran Translokation Schritt17. Rund um die Spore Schutzschichten bestehen aus mehr als 70 verschiedene Proteine10 und sind flexibel genug, um große Fremdeiweiße ohne offensichtlich Konstruktionsfehler oder Funktionsbeeinträchtigung8akzeptieren. Darüber hinaus ist die Membran Translokation des heterologen Proteins mit beiden Spore-basierte Display-Systeme nicht erforderlich8,9. In der Tat heterologen Proteine entweder in der Mutterzelle Zytoplasma hergestellt und montiert auf der Spore, die im gleichen Zytoplasma bildet oder adsorbiert an der Reifen Spore8,9.
Spore-Anzeige wurde zunächst durch die Entwicklung einer genetischen Systems um die Spore Oberfläche18Ingenieur erhalten. Dieses genetische System beruhte auf i) den Bau einer gen-Fusion zwischen der gen-Codierung für eine Spore-Hüllprotein (verwendet als Träger) und für das Protein zu kodierenden gen angezeigt – die transkriptionelle und translationale Signale von der endogenen gen steuert den Ausdruck der Verschmelzung und Ii) Integration von Chimären gen auf dem Chromosom B. Subtilis , genetische Stabilität zu gewähren. Eine Vielzahl von Antigenen und Enzyme dieser rekombinanten Ansatz, mit verschiedenen Spore Oberflächenproteine als Träger und mit dem Ziel verschiedene Anwendungsmöglichkeiten, von Schleimhaut Impfstoff bis hin zu Biokatalysator, Biosensor, Bioremediation, angezeigt worden oder bioanalytische Tool8,13.
Vor kurzem wurde ein anderer Ansatz von Spore Display entwickelten19. Diese zweite System ist nonrecombinant und stützt sich auf die spontane und extrem engen Adsorption der Moleküle auf der Oberfläche Spore-9. Antigene19,20 und Enzyme13,21 effizient angezeigt worden und haben gezeigt, dass diese Methode ist wesentlich effizienter als die rekombinante. Dieser nonrecombinant Ansatz ermöglicht die Darstellung von Proteinen in gediegener Form20 und kann auch verwendet werden, mit autoklaviert, Tod Sporen19. Der molekulare Mechanismus der Adsorption ist noch nicht vollständig geklärt. Die negative Ladung und der Hydrophobie der Spore wurden als relevanten Eigenschaften für die Adsorption13,19,22vorgeschlagen. Vor kurzem hat sich gezeigt, dass ein Modell-Protein, das rote Autofluorescent Protein (mRFP) von den Korallen Discosoma, wenn um die Spore, adsorbiert durch die Lokalisierung in der inneren Schicht23Oberflächenschichten zu infiltrieren konnte. Wenn auch für andere Proteine nachgewiesen, erklären die internen Lokalisierung der heterologen Proteine ihre erhöhte Stabilität wenn Sporen23adsorbiert.
In einer aktuellen Studie zwei Enzyme katalysieren zwei aufeinander folgenden Schritten des Xylan-Abbau-Signalwegs waren unabhängig voneinander auf Sporen von B. Subtilis angezeigt und wenn gemeinsam inkubiert wurden beide Abbau Schritte21durchführen. Sporen gesammelt, nachdem die Reaktion waren noch aktiv und können weiterhin die Xylan-Abbau auf die Zugabe von frischem Substrat21. Selbst wenn ein Verlust von etwa 15 % des Endprodukts in der zweiten Reaktion21beobachtet wurde, ist die Wiederverwendbarkeit von adsorbierten Enzyme für einzelne, als auch Multi-Step Reaktionen ein weiterer wichtiger Vorteil der Spore-Display-System.
Pan Et Al.24 berichtete eine weitere Annäherung an heterologen Proteine auf der Oberfläche der Spore anzeigen: heterologe Proteine (ein Endoglucanase Protein und ein Beta-Galaktosidase man) in die Mutterzelle in Sporenbildung erzeugt wurden spontan eingehüllt in den bildenden Spore-Mantel, ohne die Notwendigkeit eines Trägers. Diese zusätzliche Spore-Display-System ist eine Kombination der beiden Ansätze bisher beschriebenen. Tatsächlich ist es rekombinante, da die heterologe Proteine entwickelt wurden, um in der Mutterzelle während der Sporenbildung, ausgedrückt werden, während deren Montage innerhalb der Mantel spontan war und daher nonrecombinant24. Jedoch bleibt die Effizienz der Anzeige dieses zusätzliche Ansatzes getestet und verglichen mit den anderen beiden Ansätzen mithilfe der gleichen heterologen Proteinen.
Dieses Protokoll schließt die Prozesse der Spore Produktion und Reinigung, die wurden ausführlich an anderer Stelle beschrieben24. Freuen Sie sich auf die Adsorption Reaktion, die Bewertung der Effizienz der Adsorption von Dot-Blot und Fluoreszenz-Mikroskopie und rundet das recycling von adsorbierten Enzyme für zusätzliche Reaktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Spore-Adsorption-Protokoll ist sehr einfach und unkompliziert. Die Reaktion richtet sich streng nach den pH-Wert des Puffers Reaktion und die Effizienz der Adsorption ist optimal bei sauren pH-Werten (pH 5,0 oder niedriger). Im neutralen pH-Bedingungen die Effizienz der Adsorption ist gering, und bei alkalischen pH-Werten Adsorption kann nicht auftreten. Mit einem Volumen von 200 µL in 1,5 mL Röhrchen (oder ein ähnliches Verhältnis zu halten) auf einen rockigen Shaker optimalen Adsorption ergibt.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch “Finanziamento di Ricerca di Ateneo”, L. Baccigalupi, Projekttitel “SP-LAY: bakterielle Sporen als live-Plattform für die Anzeige der Proteine”.
Materials
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
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