Spore adsorptie als een Nonrecombinant Display systeem voor enzymen en antigenen
Summary
Dit protocol is gericht op het gebruik van bacteriële sporen als een “live” nanobiotechnological instrument te adsorberen heterologe moleculen met verschillende biologische activiteit. De methoden voor het meten van de doelmatigheid van de adsorptie worden ook weergegeven.
Abstract
De bacteriële spore is een metabolisch rustige cel, gevormd door een aantal beschermende lagen rond een gedehydrateerde cytoplasma. Deze bijzondere structuur maakt de spore uiterst stabiel en resistente en heeft voorgesteld het gebruik van de spore als een platform voor het weergeven van heterologe moleculen. Tot nu toe een scala aan antigenen en enzymen zijn tentoongesteld op sporen van Bacillus subtilis en een paar andere soorten, in eerste instantie door een recombinant aanpak en, vervolgens, door een eenvoudige en efficiënte nonrecombinant methode. De nonrecombinant display systeem is gebaseerd op de directe adsorptie van heterologe moleculen op het oppervlak van de spore, de bouw van recombinante stammen en de introductie van genetisch gemodificeerde bacteriën in het milieu te voorkomen. Geadsorbeerde moleculen zijn gestabiliseerd en beschermd door de interactie met sporen, waardoor de snelle afbraak van antigenen en het verlies van de enzymactiviteit bij ongunstige omstandigheden wordt beperkt. Zodra gebruikt, kunnen spore-geadsorbeerde enzymen worden verzameld gemakkelijk met een minimale vermindering van activiteit en hergebruikt voor aanvullende reactie rondes. In deze paper wordt weergegeven hoe te adsorberen model moleculen om gezuiverde sporen van B. subtilis, hoe te te evalueren van de doeltreffendheid van adsorptie en hoe verzamelt gebruikte sporen om ze te recyclen voor nieuwe reacties.
Introduction
Displaysystemen zijn gericht op de presentatie van biologisch actieve moleculen op het oppervlak van micro-organismen en toepassingen vinden in allerlei velden, uit industriële aan medische en milieu biotechnologie. Naast bacteriofagen1,2 en cellen van verschillende gram-negatieve en -positieve soorten3,4,5,6,7, bacteriële sporen ook geweest voorgesteld als displaysystemen door twee benaderingen8,9.
Door zijn bijzondere structuur, namelijk een gedehydrateerde cytoplasma omringd door een aantal beschermende lagen10, biedt de spore verschillende voordelen ten opzichte van phage en cel-gebaseerde display systemen8,9. Een eerste voordeel komt uit de extreme robuustheid en stabiliteit van sporen op voorwaarden dat zou schade wordt berokkend aan alle andere cellen10,11. Spore-weergegeven antigenen en enzymen zijn stabiel na langdurige opslag bij kamertemperatuur12 en beschermd tegen aantasting bij lage pH en hoge temperaturen13. Een tweede voordeel van sporen is de veiligheid van vele spore-vormende soorten. B. subtilis, B. clausii, B. coagulansen verschillende andere soorten wereldwijd als probiotica worden gebruikt en heb op de markt voor menselijk of dierlijk gebruik voor decennia14,15. Deze uitzonderlijke veiligheidsreputatie is een voor de hand liggende algemene vereiste voor een oppervlakte display systeem en is van bijzonder belang wanneer het systeem is bedoeld voor gebruik voor menselijke of dierlijke16. Een derde is belangrijk voordeel van een display spore-gebaseerd systeem dat het geen beperkingen voor de grootte van het molecuul dat moet worden blootgesteld. In faag gebaseerde systemen, een grote heterologe eiwit kan invloed hebben op de structuur van de Eiwitmantel, terwijl in de cel-gebaseerde systemen, het kan invloed hebben op de structuur van het membraan of kan de membraan translocatie stap17limiet/schaden. De beschermende lagen rond de spore zijn samengesteld uit meer dan 70 verschillende eiwitten10 en zijn flexibel genoeg om goed te keuren van grote buitenlandse eiwitten zonder duidelijk structurele defect of functionele bijzondere waardevermindering8. Bovendien, met beide spore gebaseerde displaysystemen is het membraan translocatie van het heterologe eiwit niet nodig8,9. Inderdaad, heterologe eiwitten zijn ofwel in het cytoplasma van de cel van de moeder geproduceerd en gemonteerd op de spore die vormt in de dezelfde cytoplasma of geadsorbeerd op de volwassen spore8,9.
Spore display was in eerste instantie verkregen door het ontwikkelen van een genetische systeem ingenieur van de spore oppervlakte18. Deze genetische systeem was gebaseerd op ik) de bouw van een gen fusie tussen het gen dat codeert voor een spore vacht eiwit (gebruikt als drager) en de gene codering voor de proteïne worden weergegeven – de aanwezigheid van de transcriptionele en translationele signalen van de endogene gen zal de controle van de expressie van de fusie, en ii) integratie van het chimeer gen op het chromosoom van B. subtilis te verlenen van de genetische stabiliteit. Een scala aan antigenen en enzymen zijn tentoongesteld door deze recombinante aanpak, met behulp van diverse spore oppervlakte eiwitten als dragers en die gericht zijn op verschillende mogelijke toepassingen, variërend van mucosal vaccin aan biokatalysator biosensor, bioremediatie, of bioanalytical gereedschap8,13.
Meer heeft, een andere benadering van spore display onlangs ontwikkelde19. Dit tweede systeem is nonrecombinant en vertrouwt op de spontane en uiterst krap adsorptie van moleculen op de oppervlakte van spore9. Antigenen19,20 en enzymen13,21 efficiënt zijn tentoongesteld en is gebleken dat deze methode is aanzienlijk efficiënter dan de recombinant. Deze nonrecombinant benadering kunt u de weergave van eiwitten in de oorspronkelijke vorm20 en kan ook worden gebruikt met gesteriliseerde met autoclaaf, dood sporen19. Het moleculaire mechanisme van adsorptie is niet volledig opgehelderd nog. De negatieve lading en de hydrophobicity van de spore voorgesteld als relevante eigenschappen voor de adsorptie13,19,22. Onlangs is gebleken dat een model eiwit, de rode autofluorescent proteïne (mRFP) van het koraal Discosoma, wanneer geadsorbeerd aan het spore, kon infiltreren door de oppervlakte lagen lokaliseren in de innerlijke vacht23. Als bewaarheid voor andere proteïnen, uitleggen de interne lokalisatie van de heterologe eiwitten hun verhoogde stabiliteit wanneer geadsorbeerde tot en met23van de sporen.
In een recente studie, twee enzymen katalyseren van twee opeenvolgende stappen van het traject van de afbraak Xylaan hingen onafhankelijk op sporen van B. subtilis en, wanneer geïncubeerd samen konden uitvoeren van beide afbraak stappen21. Sporen verzameld na de reactie waren nog steeds actief en kunnen blijven de Xylaan afbraak op de toevoeging van vers basismateriaal21. Zelfs als een verlies van ongeveer 15% van het eindproduct werd waargenomen in de tweede reactie21, is de herbruikbaarheid van geadsorbeerde enzymen voor één, evenals scriptingregel, reacties een belangrijk bijkomend voordeel van de spore display systeem.
Pan et al.24 gemeld een aanvullende benadering om weer te geven van heterologe eiwitten op het oppervlak van de spore: heterologe eiwitten (een endoglucanase eiwit en een beta-galactosidase een) geproduceerd in de cel van de moeder tijdens de sporevorming werden spontaan ingekapseld in de vormende spore jas, zonder de noodzaak van een vervoerder. Deze bijkomende spore display systeem is een combinatie van deze twee benaderingen die tot nu toe beschreven. Inderdaad, het is recombinant aangezien de heterologe eiwitten zijn ontworpen om te worden uitgedrukt in de cel van de moeder tijdens de sporevorming, terwijl hun vergadering binnen de vacht spontaan was en dus nonrecombinant24. De efficiëntie van de weergave van deze aanvullende benadering blijft echter om te worden getest en vergeleken met de andere twee benaderingen met behulp van de dezelfde heterologe eiwitten.
Dit protocol omvat niet de processen van spore productie en zuivering, die al uitgebreid elders24beschreven. Het omvat de adsorptie-reactie, de evaluatie van de efficiëntie van adsorptie door dot-bevlekken en fluorescentie microscopie, en de recycling van geadsorbeerde enzymen voor aanvullende reactie rondes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol spore adsorptie is zeer eenvoudig en ongecompliceerd. De reactie is strikt afhankelijk van de pH van de buffer van de reactie en de efficiëntie van adsorptie is optimaal bij zure pH-waarden (pH 5.0 of lager). Bij neutrale pH-omstandigheden, de efficiëntie van adsorptie is laag, en bij alkalische pH waardes, adsorptie niet kan optreden. Optimale adsorptie wordt verkregen met behulp van een volume van 200 µL in 1,5 mL buizen (of een vergelijkbare verhouding te houden) op een rockende shaker.
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de “Finanziamento di Ricerca di Ateneo” naar L. Baccigalupi, titel van het project “SP-LAY: bacteriële sporen als live platform voor eiwitten weergave”.
Materials
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
References
- Felici, F., et al. Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage. Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).
- Cortese, R., et al. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).
- Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).
- Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).
- Wu, J. Y., et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).
- Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. Science. 244, 70-72 (1989).
- Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery. Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).
- Isticato, R., Ricca, E. Spore surface display. Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).
- Ricca, E., et al. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).
- Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).
- Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Display of molecules on the spore surface. Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).
- Sirec, T., et al. Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).
- Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).
- Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics. International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).
- Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. Microbial cell-surface display. Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).
- Isticato, R., et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).
- Huang, J. M., et al. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).
- Isticato, R., et al. Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).
- Mattossovich, R., et al. Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes. Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).
- Pesce, G., et al. Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).
- Donadio, G., et al. Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).
- Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. Display of native proteins on Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).
- Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. Genetic analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).
- Lanzilli, M., et al. Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium. New Biotechnology. 46, 38 (2018).
