Spore adsorpsiyon enzimler ve antijenleri için Nonrecombinant görüntü sistemi olarak
Summary
Bu iletişim kuralı Contegra molekülleri çeşitli biyolojik etkinlikler ile absorbe için bir “canlı” nanobiotechnological araç olarak bakteriyel sporlar kullanımı üzerinde duruluyor. Adsorpsiyon verimini ölçmek için yöntemleri de gösterilir.
Abstract
Bakteri spor koruyucu Katmanlar susuz bir sitoplazma çevreleyen bir dizi tarafından kurulan metabolik olarak sakin bir hücredir. Bu kendine özgü yapısı son derece sağlam ve dayanıklı spor yapar ve spor kullanım Contegra molekülleri görüntülemek için bir platform olarak önerdi. Şimdiye kadar çeşitli antijenleri ve enzimler görüntülenen sporlar Bacillus subtilis ve birkaç diğer türler üzerinde başlangıçta rekombinant bir yaklaşım tarafından ve daha sonra basit ve etkili bir nonrecombinant yöntemi tarafından. Nonrecombinant görüntüleme sistemi doğrudan adsorpsiyon rekombinant suşları inşaat ve çevre genetiği değiştirilmiş bakteri sürümü kaçınarak spore yüzeyi Contegra moleküllerin temel alır. Adsorbe molekülleri stabilize ve sınırlarını antijenleri hızlı yıkımı ve olumsuz koşullar, enzim aktivitesinin kaybı sporlar, etkileşim tarafından korunmaktadır. Bir kez kullanılan, spor adsorbe enzimler kolayca etkinliği en az bir azalma ile toplanan ve ek tepki tur için yeniden kullanılabilir. Bu yazıda modeli molekülleri saf sporlar B. subtilisiçin absorbe, adsorpsiyon verimliliğini değerlendirmek ve onları yeni reaksiyonlar için geri dönüşüm için kullanılan sporlar toplamak gösterilir.
Introduction
Görüntü sistemleri biyolojik olarak aktif molekülleri mikroorganizmaların yüzeyinde sunulması ve alanları, sanayi sağlık ve Çevre Biyoteknoloji için çeşitli uygulamalar bulma hedefleniyor. Phages1,2 ve çeşitli Ayagin Gram-negatif – pozitif türler ve3,4,5,6,7, hücrelerin yanı sıra bakteriyel sporlar de olmuştur görüntü sistemleri iki yaklaşım8,9tarafından önerilen.
Kendine özgü yapısını, yani koruyucu Katmanlar10, bir dizi tarafından çevrili bir susuz sitoplazma nedeniyle spor fajının ve hücre tabanlı görüntü sistemleri8,9çeşitli avantajlar sağlar. İlk bir avantaj aşırı sağlamlık ve tüm diğer hücreleri10,11için zararlı olacağını koşulları, sporlar kararlılığını gelir. Spore görüntülenen antijenleri ve enzimler sonra depolama oda sıcaklığında12 uzun süreli ve düşük pH ve yüksek sıcaklıklara13düşüş korunuyorsunuz stabildir. İkinci avantajı sporlar spor oluşturan birçok türün güvenliğidir. B. subtilis, d. clausii, d. coagulansve birkaç diğer türler probiyotikler olarak dünya çapında kullanılan ve onlarca yıl14,15insan ya da hayvan kullanılmak için piyasada olmuştur. Bu olağanüstü güvenlik sicili bir yüzey görüntüleme sistemi için açık bir genel gereksinimi ve sistem insan ya da hayvan kullanım16için amaçlanan belirli alaka. Bir üçüncü önemli bir spor tabanlı görüntü sistemi maruz vardır molekülün boyutu sınırlamaları yok avantajdır. Feyc tabanlı sistemlerde, bir büyük Contegra protein yapısı etkileyebilir kapsid, hücre tabanlı sistemlerde ise, bu membran yapısı etkileyebilir veya limit/membran translocation adım17bozabilen. Spore çevreleyen koruyucu Katmanlar 70’den fazla farklı proteinler10 / oluşmaktadır ve herhangi bir belirgin yapısal kusur veya fonksiyonel bozukluğu8olmadan büyük yabancı proteinler kabul verecek kadar esnektir. Buna ek olarak, her iki spor tabanlı görüntü sistemleri, membran translocation kapaklı protein değil gerekli8,9‘ dur. Nitekim, kapaklı proteinler ya anne hücre sitoplazma içinde üretilen ve aynı sitoplazma oluşuyor veya olgun spor8,9tarihinde adsorbe spore monte.
Spore görüntü başlangıçta spore yüzey18mühendisi genetik bir sistem geliştirerek elde edildi. Bu genetik sistem üzerinde dayalı) bir gen füzyon gen (bir taşıyıcı olarak kullanılan) bir spor ceket protein desteği ve gen olmak için protein arasındaki inşaat görüntülenen – transkripsiyon ve çevirim sinyalleri endojen varlığı Gen füzyon ve II ifadesi kontrol) genetik istikrar vermek için B. subtilis kromozom üzerinde chimeric gen entegrasyonu. Çeşitli spor yüzey proteinleri kullanarak taşıyıcıları ve çeşitli olası uygulamaları hedefleyen, Mukozal aşı değişen biocatalyst, Biyoalgılayıcı, Biyoremidasyon, rekombinant bu yaklaşım tarafından görüntülenen çeşitli antijenleri ve enzimler veya bioanalytical aracı8,13.
Daha yakın zamanlarda, farklı bir yaklaşım spor ekranının gelişmiş19olmuştur. Bu ikinci sistem nonrecombinant ve spontan ve son derece sıkı adsorpsiyon spore yüzey9moleküllerin dayanmaktadır. Antijenleri19,20 ve enzimler13,21 verimli bir şekilde görüntülenen ve bu yöntem rekombinant bir daha önemli ölçüde daha etkili olduğunu ortaya koymuştur. Nonrecombinant bu yaklaşım içinde yerel form20 protein görüntülenmesine izin verir ve ayrıca autoclaved ile kullanılabilir, ölüm19sporlar. Adsorpsiyon moleküler mekanizması tam olarak henüz açıklık olmuştur değil. Negatif yük ve spor hydrophobicity ilgili özellikler olarak adsorpsiyon13,19,22için önerilmiştir. Son zamanlarda, bir modeli protein, spore için adsorbe zaman mercan Discosoma, kırmızı autofluorescent protein (mRFP) iç kat23‘ yerelleştirme yüzey katmanı üzerinden sızmayı başardı gösterilmiştir. Diğer proteinler için gerçek olduğunu kanıtladı, kapaklı proteinlerin iç yerelleştirme sporlar23adsorbe zaman onların artan istikrar açıklar.
Son bir çalışmada, iki enzim xylan bozulması yolun iki ardışık adımlar katalizlerler B. subtilis sporlar üzerinde bağımsız olarak sergilendi ve birlikte, inkübe zaman her iki bozulması adımları21gerçekleştirmek başardık. Reaksiyon sonra hala aktif ve güçlü-e doğru taze substrat21eklenmesi üzerine xylan bozulma devam sporlar toplanan. Nihai ürünün yaklaşık % 15 kaybı ikinci reaksiyon21‘ gözlendi, adsorbe enzimler tek yanı sıra çok adımlı, tepkiler kullanılırlığı spore görüntüleme sistemi önemli bir avantajı olsa bile.
Pan ve ark.24 bildirdi Contegra proteinler spore yüzeyinde görüntülemek için ek bir yaklaşım: Anne hücrede sporulation sırasında üretilen Contegra proteinler (bir endoglucanase protein ve bir beta-galaktozidaz biri) idi kendiliğinden şekillendirme spor ceket, bir taşıyıcı, gerek kalmadan kaplı. Bu ek spore görüntüleme sistemi defa açıklanan iki yaklaşım bir kombinasyonudur. Nitekim, rekombinant Contegra proteinler onların derleme ceket içinde spontan iken anne hücrede sporulation sırasında ifade için tasarlanmış bu yana ve bu nedenle, nonrecombinant24. Ancak, bu ek yaklaşım görüntüsünü verimliliğini test ve aynı Contegra proteinler kullanarak diğer iki yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında kalır.
Spore üretim süreçlerinin mevcut Protokolü dışlar ve olmuştur arıtma kapsamlı bir şekilde başka bir24bölümünde. Adsorpsiyon tepki, adsorpsiyon dot Blot ve floresan mikroskopisi tarafından verimliliğini değerlendirme içerir ve adsorbe enzimler ek tepki için geri dönüşüm yuvarlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu spor adsorpsiyon çok basit ve kolay iletişim kuralıdır. Reaksiyon kesinlikle tepki tamponunun pH bağımlıdır ve adsorpsiyon verimini asidik pH değerlerinde (pH 5.0 veya daha düşük) en iyi yöntemdir. Nötr pH koşulları, adsorpsiyon verimliliği düşüktür ve alkali pH değerlerinde adsorpsiyon değil oluşabilir. En iyi adsorpsiyon 1,5 mL tüpler (veya benzer bir oranı tutmak) 200 µL hacmi üzerinde sallanan bir shaker kullanarak elde edilir.
Adsorpsiyon çok sıkı ve yık…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser “Finanziamento di Ricerca di Ateneo” L. Baccigalupi, proje başlığı için tarafından desteklenen “SP-LAY: bakteriyel sporlar proteinler görüntü için canlı platform olarak”.
Materials
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
References
- Felici, F., et al. Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage. Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).
- Cortese, R., et al. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).
- Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).
- Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).
- Wu, J. Y., et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).
- Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. Science. 244, 70-72 (1989).
- Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery. Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).
- Isticato, R., Ricca, E. Spore surface display. Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).
- Ricca, E., et al. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).
- Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).
- Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Display of molecules on the spore surface. Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).
- Sirec, T., et al. Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).
- Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).
- Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics. International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).
- Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. Microbial cell-surface display. Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).
- Isticato, R., et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).
- Huang, J. M., et al. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).
- Isticato, R., et al. Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).
- Mattossovich, R., et al. Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes. Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).
- Pesce, G., et al. Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).
- Donadio, G., et al. Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).
- Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. Display of native proteins on Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).
- Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. Genetic analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).
- Lanzilli, M., et al. Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium. New Biotechnology. 46, 38 (2018).
