酵素の抗原 Nonrecombinant 表示システムとして胞子吸着
Summary
このプロトコルは細菌の胞子の様々 な生物活性を持つ異種分子を吸着する「ライブ」nanobiotechnological ツールとしての使用に焦点を当てください。吸着の効率を測定する方法も示します。
Abstract
細菌の胞子は、周囲の水分を取り除かれた細胞質の保護層のシリーズによって形成された、静止代謝セルです。この独特な構造は胞子は、非常に安定して強いと胞子の異種分子を表示するためのプラットフォームとしての使用を示唆しています。ところ、組換えアプローチによって最初とし、シンプルで効率的な nonrecombinant 法による様々 な抗原、酵素を枯草菌と他のいくつかの種の胞子に表示されています。Nonrecombinant ディスプレイ システムは、組換え系統の建設と環境で遺伝子組み換え細菌のリリースを回避する胞子表面に異種分子の直接吸着に基づいています。吸着分子が安定し、抗原の急速な劣化と不利な条件で酵素活性の損失を制限する胞子との相互作用によって保護されました。利用、一度胞子を吸着した酵素を活動の最小の縮小を簡単に収集し、追加反応ラウンドで再利用できます。本稿では、枯草の精製胞子モデル分子を吸着する方法、吸着の効率を評価する方法、新しい反応のためリサイクルすること使用される胞子を収集する方法に表示されます。
Introduction
ディスプレイ システムは、微生物の表面の生理活性分子を提示し、様々 な分野医療・環境バイオ テクノロジー工業用からのアプリケーションを見つけることを目指しています。また、されている細菌胞子ファージ1,2と様々 なグラム陰性菌および肯定的な種の3,4,5,6、7、セルに加えて2 つのアプローチ8,9で表示システムとして提案。
その特異な構造、すなわち保護層10のシリーズに囲まれて脱水細胞質のため胞子はバクテリオファージとセルベースのディスプレイ システムの8,9以上のいくつかの利点を提供します。最初の利点は、極端な堅牢性とすべて他セル10,11劇物になる条件下で胞子の安定性から来ています。胞子表示抗原、酵素が安定後長期保管常温12低 pH と高温13劣化から保護します。胞子の 2 番目の利点は、胞子形成の多くの種の安全性です。枯草、B. 遺伝子のクローニング、B. coagulans、および他のいくつかの種プロバイオティクスとして世界的に使用され、数十年14,15に人間または動物の使用のための市場にされています。この例外的な安全記録は表面ディスプレイ システムの明白な一般的な要件特定の関連性の場合とシステムは、人間や動物の使用16用です。3 分の 1、胞子型ディスプレイ システムの重要な利点は公開するには分子のサイズに制限はありません。バクテリオファージ ベースのシステムで大規模な異種タンパク質構造に影響可能性がありますキャプシドのセルベースのシステム中、膜の構造に影響を与える可能性がありますか膜移行手順17を制限/損なうことがあります。胞子を取り巻く保護層は 70 以上の異なるタンパク質10で構成され、明らかに構造上の欠陥または機能障害8なし大型外国蛋白質を受け入れる柔軟性します。さらに、両方の胞子ベースの表示システムによる異種タンパク質の膜移行は必要な8,9ではありません。確かに、異種の蛋白質か母細胞質で作ら、同じ細胞で形成され、成熟した胞子8,9に吸着した胞子の組み立ています。
胞子表示は当初胞子表面18をエンジニア リングする遺伝的システムの開発によって得られました。この遺伝的システムは、私に基づいていた) (キャリアとして使用) 胞子コート蛋白質の遺伝子のコーディングとするタンパク質の遺伝子のコーディングの遺伝子融合の構造表示されます -、内因性の転写と翻訳のシグナルの存在遺伝子は融合、および ii の発現を制御する) 遺伝的安定性を付与する枯草染色体のキメラ遺伝子の統合。様々 な抗原、酵素はキャリアと様々 な応用を目指して、生体触媒、バイオ センサー、バイオレメディエーション、粘膜ワクチンに至る様々 な胞子表面蛋白質を使用して、この組換え方法によって表示されているかバイオ分析ツール8,13。
最近では、胞子の表示の異なるアプローチは、開発19をされています。この 2 番目のシステムは nonrecombinant、胞子表面9分子の自発的な非常にタイトな吸着します。抗原19,20と酵素13,21は、効率的が表示されているし、このメソッドは組換えのものよりも大幅に効率化を明らかにしました。この nonrecombinant アプローチ ネイティブ フォーム20の蛋白質の表示が可能、死胞子19オートクレーブで使用もできます。吸着の分子メカニズムはまだ完全に解明されていません。胞子の疎水性と負の電荷は、吸着13,19,22の関連するプロパティとして提案されています。最近では、モデル蛋白質、サンゴDiscosoma胞子を吸着したときの赤色蛍光タンパク質 (mRFP) はインナー コート23でローカライズする表面層を介して侵入することが示されています。他の蛋白質の真の証明、異種の蛋白質の内部のローカリゼーションは胞子23に吸着したとき彼らの高められた安定性を説明できます。
最近の研究では、2 つの酵素が触媒するキシラン分解経路の 2 つの連続する手順はあったB. 枯草菌の胞子に独立して表示されないとときに、一緒に、培養された両方の分解手順21を実行することができます。胞子は、反応がまだ活躍し新鮮な基板21の付加にキシランの分解を続けることができる後に収集されました。最終製品の約 15% の損失は、第 2 反応21で観察された、場合でも複数のステップと同様に、単一反応吸着酵素の再利用性は胞子表示システムの追加の重要な利点です。
パンら24報告胞子表面に異種タンパク質を表示する追加のアプローチ: 母細胞で胞子形成中に生産の異種の蛋白質 (エンドグルカナーゼ タンパク質と β-ガラクトシダーゼの 1 つ) が自発的にキャリアを必要とせず、成形の胞子コートを包んだ。この追加胞子ディスプレイ システムは、これまで説明した 2 つのアプローチの組み合わせです。確かに、それは遺伝子組換え異種タンパク質がコート内でそのアセンブリは自発だった一方、胞子形成期母細胞で表される設計されたので、したがって、nonrecombinant24。ただし、この追加方法の表示の効率化は、テストと同じ異種タンパク質を利用した他の 2 つのアプローチと比較して残ります。
この議定書は胞子生産のプロセスを除外し、精製されている広範囲の場所24説明しました。吸着反応、ドットしみが付くことおよび蛍光顕微鏡による吸着の効率性の評価が含まれています、ラウンド追加反応吸着酵素のリサイクルします。
Protocol
Representative Results
Discussion
この胞子吸着プロトコルは非常に簡単です。反応は反応バッファーの pH に依存、吸着の効率は酸性 pH 値 (pH 5.0 以下) に最適です。中性条件下で吸着効率が低くとアルカリ pH 値で吸着が発生しません。最適な吸着は、ロッキング シェーカーで 1.5 mL チューブ (または同じような比率を維持する) に 200 μ L のボリュームを使用して取得されます。
吸着は非常にタイトと反応?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、l. Baccigalupi、プロジェクトのタイトルに「Finanziamento ・ ディ ・ Ricerca ・ ディ ・ アテネオ」によって支えられた「SP レイ: タンパク質ディスプレイ用 live プラットフォームとしては細菌の胞子します」.
Materials
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
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