효소와 항 원에 대 한 Nonrecombinant 디스플레이 시스템으로 포자 흡착
Summary
이 프로토콜은 다양 한 생물 학적 활동 분리 분자를 흡착 하는 “라이브” nanobiotechnological 도구로 세균성 포자의 사용에 초점을 맞추고. 흡착의 효율성을 측정 하는 방법도 표시 됩니다.
Abstract
세균성 포자 탈수 세포질을 둘러싼 보호 계층의 시리즈에 의해 형성 된 metabolically 무부하 셀입니다. 이 독특한 구조는 매우 안정적이 고 저항 하는 포자를 만드는 하 고 분리 분자를 표시 하는 플랫폼으로는 포자를 사용 하 여 제안 했다. 처음에 의해 재조합 접근 그리고, 간단 하 고 효율적인 nonrecombinant 방법에 의해 지금까지, 다양 한 항 원 및 효소 새 균의 subtilis 와 다른 몇 가지 종류의 포자에 표시가 되었습니다. Nonrecombinant 디스플레이 시스템 재조합 종자의 구조와 유전자 변형된 박테리아는 환경에의 릴리스를 피하고 포자 표면에 분자를 분리의 직접 흡착을 기반으로 합니다. 흡착된 분자는 안정 하 고 항 원의 급속 한 저하와 불리 한 조건에서 효소 활동의 손실을 제한 하 포자와 상호 작용에 의해 보호. 활용 하 고, 일단 포자 흡착 효소 활동의 최소한의 감소와 함께 쉽게 수집 고 추가 반응 라운드에 대 한 다시 사용할 수 있습니다. 이 종이에 B. subtilis의 순화 된 포자를 모델 분자를 흡착 하는 방법, 흡착의 효율성을 평가 하는 방법 및 새로운 반응에 대 한 재활용 사용된 포자를 수집 하는 방법 표시 됩니다.
Introduction
디스플레이 시스템 미생물의 표면에 생물 학적 활성 분자를 제시 하 고 다양 한 분야, 의료 및 환경 바이오를 산업에서 응용 프로그램을 찾는 겨냥 된다. 페이지1의,2 와 셀의 다양 한 그람 음성 및 긍정적인 종3,,45,,67, 세균성 포자도 있다 두 가지 방법8,9에의해 디스플레이 시스템으로 제안 했다.
독특한 구조, 즉 탈수 세포질 둘러싸여 보호 레이어10의 시리즈 때문에 포자는 몇 가지 이점을 살 균 소 및 셀 기반 디스플레이 시스템8,9를 제공 한다. 첫 번째 장점은 모든 다른 셀10,11해로운 것 조건에서 포자의 안정성과 극단적인 견고성에서 비롯 됩니다. 포자 표시 된 항 원 및 효소는 안정 후 실 온12 에서 스토리지를 연장 및 낮은 pH와 높은 온도13저하에서 보호. 포자의 두 번째 장점은 많은 포자 형성 종의 안전입니다. B. subtilis, B. clausii, B. coagulans, 그리고 다른 여러 종의 probiotics로 사용 되 고 수십 년간14,15인간 또는 동물 사용에 대 한 시장에 왔다. 이 뛰어난 안전 기록 표면 디스플레이 시스템에 대 한 분명 일반적인 요구 사항 이며 때 시스템은 인간 또는 동물 사용16를 위한 특정 한 관련성의 이다. 세 번째, 중요 한 포자 기반 디스플레이 시스템의 장점은 노출 되는 분자의 크기에 대 한 한계는 없습니다. 페이지 기반 시스템에서 분리 단백질이 큰 영향을 미칠 수 구조는 capsid의 셀 기반 시스템에 (서) 동안 그것은 막의 구조에 영향을 미칠 수 있습니다 또는 저하 될 수 있습니다 제한/막 전 단계17. 포자를 둘러싼 보호 계층 이상의 70 다른 단백질10 으로 구성 되며 분명 구조적 결함 또는 기능 장애8없이 큰 외국 단백질을 받아들일 수 있도록 유연. 또한, 두 포자 기반 디스플레이 시스템과 분리 단백질의 막 전은 하지 필요한8,9. 실제로, 분리 단백질 중 어머니 세포 세포질에서 생산 되며 동일한 세포질에 형성 또는 성숙한 포자8,9에 흡착 하는 포자에 조립.
포자 디스플레이 처음 포자 표면18를 유전자 시스템을 개발 하 여 얻은 했다. 이 유전자 시스템에 근거 했다) (캐리어로 사용) 포자 외 투 단백질을 위한 유전자 코딩 하 고 되도록 단백질을 위한 유전자 코딩 사이의 유전자 융합 건설 표시-는 내 생의 transcriptional 변환 신호 존재 유전자 융해, 및 ii의 식을 제어) 유전적 안정성을 부여 하는 B. subtilis 염색체에 공상 유전자의 통합. 항 원 및 효소의 다양 한 항공사와 다양 한 잠재적인 응용 프로그램을 겨냥, biocatalyst, 바이오 센서, bioremediation, 점 막 백신에서까지 다양 한 포자 표면 단백질을 사용 하 여이 재조합 형 접근 방식에 의해 표시 되었습니다 또는 생물 도구8,13.
더 최근에, 포자 디스플레이의 다른 접근 방식이 개발된19되었습니다. 이 두 번째 시스템은 nonrecombinant 고9포자 표면 분자의 자연과 매우 엄격한 흡착 한다. 항 원19,20 및 효소13,21 효율적으로 표시 되었습니다 그리고이 방법은 재조합 형 보다 훨씬 더 효율적 이다 하는 것을 계시 했다. Nonrecombinant 이렇게 네이티브 양식20 에서 단백질의 디스플레이 허용 하 고 사용할 수 있습니다 또한 압력가, 죽음 포자19. 흡착의 분자 메커니즘은 하지 되었습니다 완전히 명백 하 게 아직. 네거티브 차지 하 고 있는 포자의 hydrophobicity 흡착13,,1922에 대 한 관련 속성으로 제안 되었습니다. 최근에, 그것은 모델 단백질, 빨간 autofluorescent 단백질 (mRFP)는 산호 Discosoma, 포자에 흡착 할 때의 내부 코트23에 지역화 표면 레이어를 통해 침투 수 있었습니다 표시 되었습니다. 다른 단백질에 대 한 사실 증명, 분리 단백질의 내부 지역화 포자23에 흡착 될 때 그들의 증가 한 안정성을 설명할 수 있었다.
최근 연구에서 두 효소 catalyzing xylan 저하 통로의 2 개의 연속적인 단계 B. subtilis 의 포자에 독립적으로 표시 했다 고, 함께 알을 품을 때 모두 저하 단계21를 수행 수 있었다. 포자 수집 후 반응 했다 여전히 적극적이 고 신선한 기판21의 추가 따라 xylan 저하를 계속할 수 있습니다. 경우에 최종 제품의 약 15%의 손실 두 번째 반응21에서 관찰 되었다, 다단계, 뿐만 아니라, 단일 반응에 대 한 흡착된 효소의 재사용은 포자 디스플레이 시스템의 추가 중요 한 이점이 다.
팬 외.24 보고 포자 표면에 분리 단백질을 표시 하는 추가 접근: 포자 형성 동안 어머니 셀에서 생산 분리 단백질 (endoglucanase 단백질 및 베타-galactosidase 하나) 자발적으로 했다 운반대의 필요 없이 형성 포자 외 투에 쌌 다. 이 추가 포자 디스플레이 시스템은 지금까지 설명 된 두 가지 방법의 조합. 사실, 그것은 재조합 이후 분리 단백질 코트 내 자신의 어셈블리 자발적인 동안 포자 형성, 동안 어머니 세포에 표현 될 설계 했다 및, 따라서, nonrecombinant24. 그러나,이 추가적인 접근의 표시의 효율성을 테스트 하 고 동일한 분리 단백질을 사용 하 여 다른 두 방법에 비해 남아 있다.
현재 프로토콜 포자 생산의 프로세스를 제외 하 고 정화 되었습니다 설명 되어 광범위 하 게24. 흡착 반응, 도트 blotting과 형광 현미경에 의해 흡착 효율 평가 및 라운드 추가 반응에 대 한 흡착된 효소의 재활용.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 포자 흡착 프로토콜은 매우 단순 하 고 간단. 반응이 반응 버퍼의 pH에 엄격 하 게 의존 하 고 흡착 효율은 산 성 pH 값 (pH 5.0 또는 더 낮은)에서 최적의. 중립 pH 조건에서 흡착 효율은 낮은, 그리고 알칼리 성 pH 값에서 흡착 하지 발생할 수 있습니다. 최적의 흡착 락 통에 1.5 mL 튜브 (또는 비슷한 비율을 유지)에 200 µ L의 볼륨을 사용 하 여 얻을 수 있습니다.
흡착이 매우 빡 빡 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 “Finanziamento 디 검색 디 Ateneo” L. Baccigalupi, 프로젝트 제목에 의해 지원 되었다 “SP-레이: 세균성 포자 단백질 디스플레이 대 한 라이브 플랫폼으로”.
Materials
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
References
- Felici, F., et al. Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage. Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).
- Cortese, R., et al. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).
- Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).
- Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).
- Wu, J. Y., et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).
- Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. Science. 244, 70-72 (1989).
- Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery. Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).
- Isticato, R., Ricca, E. Spore surface display. Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).
- Ricca, E., et al. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).
- Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).
- Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Display of molecules on the spore surface. Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).
- Sirec, T., et al. Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).
- Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).
- Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics. International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).
- Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. Microbial cell-surface display. Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).
- Isticato, R., et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).
- Huang, J. M., et al. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).
- Isticato, R., et al. Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).
- Mattossovich, R., et al. Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes. Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).
- Pesce, G., et al. Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).
- Donadio, G., et al. Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).
- Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. Display of native proteins on Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).
- Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. Genetic analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).
- Lanzilli, M., et al. Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium. New Biotechnology. 46, 38 (2018).
