Spore Adsorption som et Nonrecombinant displaysystem for enzymer og antigener
Summary
Denne protokol fokuserer på brugen af bakteriesporer som en “levende” nanobiotechnological redskab til adsorberes heterolog molekyler med forskellige biologiske aktiviteter. Metoder til at måle effektiviteten af adsorption er også vist.
Abstract
Den bakterielle spore er en metabolisk inaktiv celle, dannet af en række beskyttende lag omkring en dehydreret cytoplasma. Denne ejendommelige struktur gør at spore yderst stabil og modstandsdygtig og har foreslået brugen af spore som en platform til at vise heterolog molekyler. Hidtil har en bred vifte af antigener og enzymer er blevet vist på sporer af Bacillus subtilis og et par andre arter, i første omgang af en rekombinant tilgang og derefter, efter en enkel og effektiv metode, nonrecombinant. Nonrecombinant display-system er baseret på direkte adsorption af heterolog molekyler på spore overflade, undgå opførelsen af rekombinant stammer og frigivelsen af genetisk modificerede bakterier i miljøet. Adsorberede molekyler er stabiliseret og beskyttet af samspillet med sporer, som begrænser den hurtige forringelse af antigener og tabet af enzymaktivitet på ugunstige betingelser. Når udnyttet, kan spore-adsorberet enzymer indsamlet nemt med en minimal reduktion af aktivitet og genbrugt til yderligere reaktion runder. I dette papir er vist sådan adsorberes model molekyler til renset sporer af B. subtilis, sådan at evaluere effektiviteten af adsorption, og hvordan de skal indsamle brugte sporer for at genbruge dem til nye reaktioner.
Introduction
Display-systemer er rettet mod præsenterer biologisk aktive molekyler på overfladen af mikroorganismer og at finde programmer i en række forskellige områder, fra industrielle medicinske og miljømæssige bioteknologi. Ud over phages1,2 og celler i forskellige Gram-negative og -positive arter,3,4,5,6,7, har bakteriesporer også været foreslået som display systemer af to tilgange8,9.
På grund af sin særlige struktur, nemlig en dehydreret cytoplasma omgivet af en række beskyttende lag10, giver spore adskillige fordele i forhold til fag – og cellebaserede display systemer8,9. En første fordel kommer fra den ekstreme robusthed og stabilitet af sporer på betingelser, der ville være skadelig for alle andre celler10,11. Spore-vises antigener og enzymer er stabil efter længere tids opbevaring ved stuetemperatur12 og beskyttet mod nedbrydningen ved lav pH og høje temperaturer13. En anden fordel af sporer er sikkerheden for mange sporedannelse danner arter. B. subtilis, B. clausii, B. coagulans, og flere andre arter bruges verden over som probiotika og har været på markedet for menneskers eller dyrs brug for årtier14,15. Denne ekstraordinære sikkerhedsstatistik er en indlysende generelle krav for en overflade displaysystem og er af særlig relevans, når systemet er beregnet til konsum eller foderbrug Brug16. En tredje, er vigtig fordel af en spore-baseret displaysystem at det ikke har begrænsninger for størrelsen af molekylet, der skal udsættes. I phage-baserede systemer, en stor heterolog protein kan påvirke strukturen af kapsid, mens i celle-baserede systemer, det kan påvirke struktur af membran eller kan grænse/forringe membran translokation trin17. De beskyttende lag omkring spore er sammensat af mere end 70 forskellige proteiner10 og er fleksibel nok til at acceptere store udenlandske proteiner uden nogen indlysende konstruktionsfejl eller funktionelle svækkelse8. Derudover med både spore-baseret display systemer er membran omplantning af heterolog protein ikke kræves8,9. Faktisk er heterolog proteiner enten fremstillet i mor cellen cytoplasma og samlet på den spore, der er danner i samme cytoplasmaet eller adsorberet på modne spore8,9.
Spore display blev oprindeligt fremstillet ved at udvikle et genetisk system ingeniør spore overflade18. Denne genetiske systemet var baseret på jeg) opbygningen af et gen fusion mellem det gen, der koder for en spore frakke protein (anvendes som bærestof) og genet koder for proteinet skal vises – tilstedeværelsen af det transkriptionel og translationel signaler af den endogene gen vil kontrollere udtrykket af den fusion, og ii) integration af kimære-gen på B. subtilis kromosom at yde genetisk stabilitet. En bred vifte af antigener og enzymer, der vises af denne rekombinant tilgang, ved hjælp af forskellige sporedannelse overflade proteiner som luftfartsselskaber og sigter mod forskellige potentielle applikationer, der spænder fra slimhinden vaccine til biocatalyst, biosensor, bioremediering, eller bioanalytisk værktøj8,13.
For nylig har har en anderledes tilgang af spore display været udviklede19. Dette andet system er nonrecombinant og bygger på den spontane og yderst stramme adsorption af molekyler på spore overflade9. Antigener19,20 og enzymer13,21 har været effektivt vises og har afsløret, at denne metode er betydeligt mere effektiv end den rekombinante. Denne nonrecombinant tilgang giver mulighed for visning af proteiner i oprindelig form20 og kan også bruges med autoklaveres, død sporer19. Den molekylære mekanisme af adsorption er ikke fuldt klarlagt endnu. Den negative ladning og hydrophobicity af spore er blevet foreslået som egenskaber for relevante for adsorption13,19,22. For nylig, har det vist at en model protein, røde autofluorescent protein (mRFP) af de koraller Discosoma, når adsorberet til spore, kunne infiltrere gennem de overflade lag lokalisering i indre frakke23. Hvis viste sig rigtigt for andre proteiner, kan interne lokaliseringen af de heterolog proteiner forklare deres øget stabilitet, når adsorberet til sporer23.
I en nylig undersøgelse, to enzymer katalysere to successive trin af Nedbrydningsvejen xylan var uafhængigt vises på sporer af B. subtilis , og når inkuberes sammen, var i stand til at udføre både nedbrydning trin21. Sporer indsamlet efter reaktionen var stadig aktive og kan fortsætte xylan nedbrydning ved tilsætning af friske substrat21. Selvom et tab på omkring 15% af det endelige produkt blev observeret i den anden reaktion21, er genbrugelighed af adsorberet enzymer til enkelt, såvel som Multi-trins, reaktioner en yderligere vigtig fordel af spore displaysystem.
Pan et al.24 rapporterede en yderligere tilgang til at vise heterolog proteiner på spore overfladen: heterolog proteiner (en endoglucanase protein og en beta-galactosidase en) produceret i cellen mor under sporulering var spontant indkapslet i den dannende spore pels, uden savn i en transportør. Denne yderligere spore displaysystem er en kombination af de to metoder beskrevet så langt. Faktisk er det rekombinante da heterolog proteiner blev manipuleret til at være udtrykt i cellen mor under sporulering, mens deres forsamling inden for pelsen var spontan og derfor nonrecombinant24. Effektiviteten af visning af denne yderligere tilgang er imidlertid fortsat at blive testet og sammenlignet med de andre to tilgange ved hjælp af de samme heterolog proteiner.
Denne protokol udelukker processer af spore produktion og rensning, som er blevet beskrevet udførligt andetsteds24. Det omfatter adsorption reaktion, evaluering af effektiviteten af adsorption af dot-blotting og Fluorescens mikroskopi, og genbrug af adsorberet enzymer til yderligere reaktion runder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollens spore adsorption er meget enkel og ligetil. Reaktionen er strengt afhængig reaktion buffer pH-værdi og effektivitet af adsorption er optimal på sure pH-værdi (pH 5.0 eller lavere). På neutral pH betingelser, effektiviteten af adsorption er lavt, og på alkalisk pH værdier, adsorption kan ikke forekomme. Optimal adsorption er opnået med et rumfang på 200 µL i 1,5 mL rør (eller at holde et lignende forhold) på en vuggende shaker.
Adsorptionen er meget stram, og vasker med…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af “Finanziamento di Ricerca di Ateneo” til L. Baccigalupi, projekttitel “SP-LAY: bakteriel sporer som live platform for proteiner display”.
Materials
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
References
- Felici, F., et al. Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage. Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).
- Cortese, R., et al. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).
- Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).
- Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).
- Wu, J. Y., et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).
- Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. Science. 244, 70-72 (1989).
- Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery. Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).
- Isticato, R., Ricca, E. Spore surface display. Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).
- Ricca, E., et al. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).
- Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).
- Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Display of molecules on the spore surface. Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).
- Sirec, T., et al. Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).
- Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).
- Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics. International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).
- Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. Microbial cell-surface display. Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).
- Isticato, R., et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).
- Huang, J. M., et al. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).
- Isticato, R., et al. Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).
- Mattossovich, R., et al. Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes. Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).
- Pesce, G., et al. Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).
- Donadio, G., et al. Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).
- Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. Display of native proteins on Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).
- Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. Genetic analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).
- Lanzilli, M., et al. Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium. New Biotechnology. 46, 38 (2018).
