Spore adsorpsjon som Nonrecombinant Display System for enzymer og antigener

Summary

Denne protokollen fokuserer på bruk av bakteriell spores som et “live” nanobiotechnological-verktøy for å adsorberes heterologous molekyler med ulike biologiske aktiviteter. Metodene for å måle effektiviteten av adsorpsjon vises også.

Abstract

Bakteriell spore er en metabolically quiescent celle, dannet av en rekke beskyttende lag rundt en dehydrert cytoplasma. Denne særegne strukturen gjør spore ekstremt stabil og motstandsdyktig og har foreslått bruk av spore som en plattform for å vise heterologous molekyler. Så langt, en rekke antigener og enzymer har vært vist på sporer av Bacillus subtilis og noen andre arter, først med en rekombinant tilnærming, og deretter, etter en enkel og effektiv nonrecombinant metode. Nonrecombinant skjermsystemet er basert på direkte opptak av heterologous molekyler på spore overflaten, unngå bygging av rekombinant stammer og utgivelsen av genmodifiserte bakterier i miljøet. Adsorbert molekyler er stabilisert og beskyttet av samspillet med sporer, som begrenser rask nedbrytning av antigener og tap av enzym aktivitet i ugunstige forhold. Når utnyttes, kan spore-adsorbert enzymer samlet lett med minimal reduksjon av aktivitet og gjenbrukes for flere reaksjon runder. I dette papiret vises slik adsorberes modell molekyler å renset sporer av B. subtilis, hvordan man skal vurdere effektiviteten av adsorpsjon og hvordan du samler brukt spores for å resirkulere dem for nye reaksjoner.

Introduction

Displaysystemer er rettet mot presentere biologisk aktive molekyler på overflaten av mikroorganismer og finne programmer i en rekke felt, fra industriell til medisinsk og miljømessige bioteknologi. I tillegg til phages^1,2 og cellene i ulike Gram-negative og -positive arter^3,4,5,6,7, har bakteriell sporer også vært foreslått som displaysystemer med to tilnærminger^8,9.

På grunn av sin særegne struktur, nemlig en dehydrert cytoplasma omgitt av en rekke beskyttende lag¹⁰, gir spore flere fordeler sammenlignet med phage – og celle-baserte display systemer^8,9. En første fordel kommer fra den ekstreme robusthet og stabilitet av sporer på forhold som ville være skadelig for alle andre celler^10,11. Spore vises antigener og enzymer er stabile etter langvarig lagring ved romtemperatur¹² og beskyttet mot fornedrelse ved lav pH og høye temperaturer¹³. En annen fordel med sporene er sikkerheten til mange spore-forming arter. B. subtilis, B. clausii, B. coagulans, og flere andre arter brukes verden over som probiotika og har vært på markedet for mennesker eller dyr bruk for tiår^14,15. Dette eksepsjonelle sikkerhet posten er en opplagt generelle forutsetning for et overflaten skjermsystem og er spesielt relevant når systemet er ment for mennesker eller dyr Bruk¹⁶. En tredje er viktig fordel av en spore-baserte vise system at den ikke har begrensninger for størrelsen av molekylet som utsettes. I phage-baserte systemer, et stort heterologous protein kan påvirke strukturen av kapsid, mens celle-baserte systemer den kan påvirke strukturen i membranen eller grense/forlengelsesslanger membran translokasjon trinn¹⁷. Beskyttende lag rundt spore består av mer enn 70 ulike proteiner¹⁰ og er fleksible nok til å akseptere store utenlandske proteiner uten tydelig strukturelle feil eller nedsatt fysisk funksjon⁸. I tillegg med systemene spore-baserte vise er membran translokasjon av heterologous protein ikke nødvendige^8,9. Faktisk er heterologous proteiner enten produsert i mor cellen cytoplasma og montert på spore som danner i samme cytoplasma eller adsorbert på eldre spore^8,9.

Spore skjermen ble først innhentet av utvikle en genetisk system til ingeniør spore overflaten¹⁸. Denne genetiske systemet var basert på jeg) bygging av en genet fusjon genet koding for en spore pels protein (brukes som en bærer) og gene koding for protein skal vises – tilstedeværelsen av transcriptional og translasjonsforskning signalene fra den endogene Gene vil kontrollere uttrykket av fusion og ii) integrering av chimeric genet på B. subtilis kromosomet gi genetisk stabilitet. En rekke antigener og enzymer har blitt vist av denne rekombinant tilnærming, med ulike spore overflaten proteiner som bærere og sikte på ulike potensielle programmer, alt fra mucosal vaksine biocatalyst, biosensor, bioremediation, eller bioanalytical verktøyet^8,13.

En annen tilnærming av spore har nylig vært utviklet¹⁹. Dette andre systemet nonrecombinant og avhengig av spontan og stramt opptak av molekyler på spore overflaten⁹. Antigener^19,20 og enzymer^13,21 har vist effektivt og har avdekket at denne metoden er betydelig mer effektiv enn den rekombinante. Denne nonrecombinant kan vise proteiner i opprinnelige form²⁰ og kan også brukes med autoklaveres, død sporer¹⁹. Molekylær mekanisme adsorpsjon er ikke fullt avklart ennå. Negativ ladning og hydrophobicity av spore har blitt foreslått som egenskaper relevante for adsorpsjon^13,19,22. Nylig har det vært vist at en modell protein, røde autofluorescent protein (mRFP) av den coral Discosoma, når adsorbert å spore, klarte å infiltrere gjennom overflaten lag lokalisere i indre lag²³. Hvis viste gjelder for andre proteiner, kunne den interne lokaliseringen av heterologous proteiner forklare deres økt stabilitet når adsorbert sporer²³.

I en fersk studie, enzymene utløse to påfølgende trinnene i xylan fornedrelse veien var uavhengig vises på sporer av B. subtilis og når ruges sammen, kunne utføre begge fornedrelse trinnene²¹. Sporer samlet etter reaksjonen var fortsatt aktiv og kan fortsette xylan nedbrytning etter tillegg av fersk substrat²¹. Selv om et tap på rundt 15% av det endelige produktet ble observert i andre reaksjon²¹, er gjenbruk av adsorbert enzymer for enkelt, samt flere trinn, reaksjoner en ekstra viktig fordel av spore display system.

Pan et al.²⁴ rapportert flere tilnærming vise heterologous proteiner spore overflaten: heterologous proteiner (en endoglucanase protein og en beta-galactosidase en) produsert i mor cellen under sporulation var spontant innkapslet i forming spore pelsen, uten behovet av en operatør. Denne ekstra spore display system er en kombinasjon av metodene beskrevet så langt. Faktisk er det rekombinant siden heterologous proteiner var konstruert for å bli uttrykt i mor cellen under sporulation, mens deres montering i pelsen var spontan og derfor nonrecombinant²⁴. Effektiviteten av visningen av denne ekstra imidlertid å være testet og sammenliknet med andre metodene ved hjelp av samme heterologous proteiner.

Nåværende protokollen ekskluderer produksjonsprosesser spore og rensing, som har vært beskrevet mye andre steder²⁴. Det inkluderer adsorpsjon reaksjonen, evaluering av effektiviteten av adsorpsjon av dot-blotting og fluorescens mikroskopi, og resirkulering av adsorbert enzymer for ekstra reaksjon runder.

Protocol

1. adsorpsjon reaksjon Inkuber 2, 5 og 10 µg av mRFP med 2 x 109 av B. subtilis vill-type renset sporer i 200 µL av bindende buffer, 50 mM natriumsitrat, pH 4.0 (16,7 mM natriumsitrat dihydrate, 33.3 mM sitronsyre) 1t ved 25 ° C på en rocking shaker (figur 1) . Sentrifuge bindende blandinger (13 000 x g i 10 min) å smuldre vekk pellets (P2 P5 og P10) og supernatants (S2, S5 og S10). Lagre supernatants for indirekte vurdering av effektivit…

Representative Results

Vellykket adsorpsjon kan vurderes av vestlige blotting. På reaksjonen, blandingen er fraksjonert med sentrifugering og vasket, og pellets brøken (figur 1) brukes til å hente overflaten proteiner. Ekstraktet er fraksjonert av SDS polyakrylamid gel geleelektroforese (side), electrotransferred til en polyvinylidene fluor (PVDF) membran, og reagerte mot primære og sekundære antistoffer. Tilstedeværelsen av proteiner av forventede størrelsen, bare i kjøref…

Discussion

Denne spore adsorpsjon protokollen er svært enkel og grei. Reaksjonen er strengt avhengig pH i bufferen som reaksjon og effektiviteten av adsorpsjon er optimal på surt pH-verdier (pH 5.0 eller lavere). På nøytral pH forhold, effektiviteten av adsorpsjon er lav, og på alkaliske pH-verdier, adsorpsjon forekomme. Optimal adsorpsjon oppnås med et volum på 200 µL i 1,5 mL rør (eller holde et lignende forhold) på en rocking shaker.

Adsorpsjon er svært stramt, og vasker med en buffer på s…

Materials

0.1% Poly-L-lysine solution	Sigma	P8920
0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane	Sartorius	M_Blotting_Membranes
100× objective UPlanF1	Olympus	microscope equipment
Bacillus subtilis strain NCIB3610	Bacillus Genetic Stock Center	3A1
BD ACCURI C6 PLUS	BD	flow cytometer
BX51	Olympus	Fluorescent microscope
Clarity	Biorad	1705060
DP70 digital camera a	Olympus	microscope equipment
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC	Thermo fisher	F-2754
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Abcam	ab6721
Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody	Sigma	A7058-1VL	used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal
SecureSlip glass coverslip	Sigma	S1815-1PAK
Superwhite Uncharged Microscope Slides	VWR	75836-190
U-CA Magnification Changer	Olympus	microscope equipment