Spore Adsorption som en Nonrecombinant displaysystem för enzymer och antigener
Summary
Detta protokoll fokuserar på användning av bakteriesporer som ett ”levande” nanobiotechnological verktyg att adsorbera heterologa molekyler med olika biologiska aktiviteter. Metoderna för att mäta effektiviteten av adsorption visas också.
Abstract
Den bakteriella spore är ett metaboliskt quiescent cell, bildas av en rad skyddande lager kring en uttorkad cytoplasman. Denna säregna struktur gör spor extremt stabil och motståndskraftig och har föreslagit användning av spor som en plattform för att Visa heterologa molekyler. En mängd antigener och enzymer har hittills visats på sporer av Bacillus subtilis och några andra arter, ursprungligen av ett rekombinant tillvägagångssätt och, sedan, genom en enkel och effektiv nonrecombinant metod. Nonrecombinant displayen systemet bygger på direkta adsorption av heterologa molekyler på spore ytan, undvika byggandet av rekombinant stammar och utsläpp av genetiskt modifierade bakterier i miljön. Adsorberade molekyler är stabiliserad och skyddas genom interaktion med sporer, som begränsar den snabba nedbrytningen av antigener och förlusten av enzymaktivitet vid unfavorable villkorar. När utnyttjas, kan spore-adsorberat enzymer samlas enkelt med en minimal driftsinskränkning och återanvändas för ytterligare reaktion rundor. I detta papper visas hur att adsorbera modell molekyler till renat sporer av B. subtilis, hur man kan utvärdera effektiviteten av adsorption och hur man samlar in begagnade sporer för att återanvända dem för nya reaktioner.
Introduction
Displaysystem syftar till att presentera biologiskt aktiva molekyler på ytan av mikroorganismer och hitta program i en mängd olika områden, från industri till medicinska och miljörelaterade bioteknik. Utöver fagocyt1,2 och celler av olika gramnegativa och -positiv arter3,4,5,6,7, har bakteriesporer också föreslås som displaysystem av två tillvägagångssätt8,9.
På grund av dess säregna struktur, nämligen en uttorkad cytoplasman omges av en rad skyddande lager10, ger spor flera fördelar jämfört med phage – och cellbaserade display system8,9. Först kommer från extrema robusthet och stabilitet av sporer på villkor som skulle vara skadliga till alla andra celler10,11. Spore-visas antigener och enzymer är stabil efter långvarig lagring vid rumstemperatur12 och skyddas från nedbrytning vid lågt pH och höga temperaturer13. En andra fördel med sporer är säkerheten för många sporbildande arter. B. subtilis, B. clausii, B. coagulansoch flera andra arter används över hela världen som probiotika och har varit på marknaden för människors eller djurs användning för årtionden14,15. Denna enastående säkerhetsrekord är ett uppenbart allmänna krav för ett surface-skärmen system och är särskilt relevant när systemet är avsett för människors eller djurs användning16. En tredje är viktig fördel med en spore-baserade displaysystem att den inte har begränsningar för storleken av den molekyl som har att exponeras. I phage-baserade system, en stor heterologa proteiner kan påverka strukturen av kapsid, medan i cell-baserat system, det kan påverka strukturen på membranet eller gräns/försämra den membran translokation steg17. De skyddande lager som omger spor består av mer än 70 olika proteiner10 och är tillräckligt flexibla för att acceptera stora främmande proteiner utan uppenbart konstruktionsfel eller funktionsnedsättning8. Med båda spore-baserade displaysystem är på membran flyttning av proteinet heterologa dessutom inte krävs8,9. Faktiskt är heterologa proteiner antingen produceras i mor cellens cytoplasma och monterat på spor som bildas i samma cytoplasman eller adsorberat på mogen spore8,9.
Spore display erhölls från början genom att utveckla ett genetiska system för ingenjör spore yta18. Denna genetiska systemet byggde på jag) byggandet av en gen fusion mellan den gen som kodar för ett spore coat protein (används som bärare) och den gen som kodar för proteinet ska visas – förekomsten av transkriptionell och translationell signalerar av den endogena gen kommer att kontrollera uttrycket av fusion, och ii) integrationen av den chimära gen på B. subtilis kromosomen att bevilja genetisk stabilitet. En mängd antigener och enzymer har visats av detta rekombinant tillvägagångssätt, med olika spore ytproteiner som bärare och som syftar till olika potentiella tillämpningar, alltifrån slemhinnor vaccin till biocatalyst, biosensor, bioremediering, eller bioanalytiska verktyg8,13.
Mer nyligen, en annan metod av spore display varit utvecklade19. Detta andra system är nonrecombinant och bygger på spontana och extremt tight adsorption av molekyler på spore yta9. Antigener19,20 och enzymer13,21 har visats effektivt och har visat att denna metod är betydligt effektivare än den rekombinanta. Detta nonrecombinant tillvägagångssätt möjliggör visning av proteiner i ursprunglig form20 och kan också användas med autoklaveras, död sporer19. Den molekylära mekanismen av adsorption har inte helt klarlagts ännu. Den negativ laddningen och den vattenavvisande egenskaper av spor har föreslagits som egenskaper som är relevanta för adsorption13,19,22. Det har nyligen visat att en modell protein, det röda autofluorescent proteinet (mRFP) av den coral Discosoma, när adsorberas till spor, kunde infiltrera genom ytskikten lokalisering i den inre coat23. Om visade sig vara sant för andra proteiner, kunde inre lokaliseringen av heterologa proteiner förklara deras ökad stabilitet när adsorberat till sporer23.
I en färsk studie, två enzym katalysera två successiva steg av xylan Nedbrytningsvägen var självständigt visas på sporer av B. subtilis och, när inkuberas tillsammans kunde utföra båda nedbrytning steg21. Sporer som samlats in efter reaktionen var fortfarande aktiva och kunna fortsätta xylan nedbrytning vid tillägg av färskt substrat21. Även om en förlust av ca 15% av den slutliga produkten observerades i andra reaktion21, är reusabilityen av adsorberat enzymer för enstaka, liksom flerstegs, reaktioner ytterligare en viktig fördel med spore displayen systemet.
Pan et al.24 rapporterade en ytterligare metod att Visa heterologa proteiner på ytan spore: heterologa proteiner (ett endoglucanase protein och en beta-galaktosidas en) produceras i modercellen under sporulering var spontant inkapslad i bilda spore pälsen, utan behov av en bärare. Detta ytterligare spore displaysystem är en kombination av de två metoderna som beskrivits hittills. Det är faktiskt rekombinant eftersom de heterologa proteinerna var konstruerad för att uttryckas i modercellen under sporulering, medan deras församling inom rocken var spontan och därmed nonrecombinant24. Effektivitet visning av denna ytterligare metod återstår emellertid vara testat och jämfört med de andra två metoderna genom att använda samma heterologa proteiner.
Protokolls utesluter produktionsprocesser spore och rening, som har varit beskrivs utförligt på annan plats24. Den innehåller adsorption reaktionen, utvärdering av effektiviteten av adsorption av dot-blotting och fluorescence mikroskopi, och återvinning av adsorberat enzymer för ytterligare reaktion rundor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta spore adsorption protokoll är mycket enkel och okomplicerad. Reaktionen är strängt beroende av pH-värdet i reaktion bufferten och effektiviteten av adsorption är optimal vid surt pH värden (pH 5.0 eller lägre). Vid neutralt pH förhållanden, effektiviteten av adsorption är låg och vid alkaliskt pH-värden, adsorption kan inte uppstå. Optimal adsorption erhålls med en volym på 200 µL i 1,5 mL rör (eller att hålla ett liknande förhållande) på en gungande shaker.
Adsorpti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av ”Finanziamento di Ricerca di Ateneo” till L. Baccigalupi, Projekttitel ”SP-LAY: bakteriell sporer som levande plattform för proteiner display”.
Materials
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
References
- Felici, F., et al. Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage. Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).
- Cortese, R., et al. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).
- Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).
- Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).
- Wu, J. Y., et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).
- Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. Science. 244, 70-72 (1989).
- Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery. Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).
- Isticato, R., Ricca, E. Spore surface display. Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).
- Ricca, E., et al. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).
- Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).
- Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Display of molecules on the spore surface. Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).
- Sirec, T., et al. Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).
- Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).
- Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics. International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).
- Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. Microbial cell-surface display. Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).
- Isticato, R., et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).
- Huang, J. M., et al. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).
- Isticato, R., et al. Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).
- Mattossovich, R., et al. Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes. Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).
- Pesce, G., et al. Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).
- Donadio, G., et al. Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).
- Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. Display of native proteins on Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).
- Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. Genetic analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).
- Lanzilli, M., et al. Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium. New Biotechnology. 46, 38 (2018).
