Weefsel voorbereiding en immunokleuring van muis craniofaciale weefsels en Ondecalcificeerd bot
Summary
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om eiwit niveaus te detecteren en te kwantificeren tijdens craniofaciale morfogenese/pathogenese door immunokleuring met behulp van muis craniofaciale weefsels als voorbeeld. Daarnaast beschrijven we een methode voor het bereiden en cryosnijden van onverdecalcificeerde harde weefsels van jonge muizen voor immunokleuring.
Abstract
Weefsel immunokleuring biedt zeer specifieke en betrouwbare detectie van eiwitten van belang binnen een bepaald weefsel. Hier beschrijven we een volledig en eenvoudig protocol om eiwit expressie te detecteren tijdens craniofaciale morfogenese/pathogenese met behulp van muis craniofaciale weefsels als voorbeeld. Het protocol bestaat uit het voorbereiden en cryosnijden van weefsels, indirecte immunofluorescentie, beeld verwerving en kwantificering. Daarnaast wordt een methode beschreven voor de bereiding en het cryosnijden van onverdecalcificeerde harde weefsels voor immunokleuring, waarbij gebruik wordt gemaakt van craniofaciale weefsels en lange botten als voorbeeld. Deze methoden zijn essentieel om de eiwit expressie en morfologische/anatomische veranderingen in verschillende weefsels te bepalen tijdens craniofaciale morfogenese/pathogenese. Ze zijn ook toepasbaar op andere weefsels met passende modificaties. Kennis van de histologie en hoge kwaliteit van secties zijn van cruciaal belang om wetenschappelijke conclusies uit experimentele uitkomsten te trekken. Mogelijke beperkingen van deze methodologie omvatten maar zijn niet beperkt tot specificiteit van antilichamen en kwantificerings problemen, die hier ook worden besproken.
Introduction
Het gezicht is een belangrijk onderdeel van de menselijke identiteit, en bestaat uit verschillende soorten weefsels, zoals epitheel, spier, bot, kraakbeen, tand. Deze weefsels zijn afgeleid van alle drie de kiem lagen: Ectoderm, endoderm en mesoderm1,2. Voor een goede patronen en ontwikkeling van craniofaciale weefsels moeten celproliferatie, overlijden en differentiatie sterk worden gecoördineerd en gereguleerd door specifieke signalerings trajecten, zoals WNT-, FGF-, hh-en BMP-trajecten3,4 ,5. Defecten in proliferatie, overleving of differentiatie van cellen zullen leiden tot craniofaciale misvormingen, die behoren tot de vaakst voorkomende aangeboren geboorteafwijkingen. Transgene muizen zijn nuttige hulpmiddelen om mechanismen te bestuderen van craniofaciale morfogenese en pathogenese1,2,3,4,5. Het begrijpen van de veranderingen in craniofaciale structuren tijdens de ontwikkeling en pathogenese zal helpen om de belangrijkste ontwikkelingsprincipes te verduidelijken, evenals de mechanismen van craniofaciale misvormingen1,2,3 ,4,5.
De kleuring van hele Mount of gesectioneerde weefsels met specifieke antilichamen is een onschatbare techniek voor het bepalen van de ruimtelijke verdeling van eiwitten van belang 6. Formeel kan weefsel immunokleuring afhangen van immunohistochemie (IHC) of immunofluorescentie (IF). Vergeleken met het ondoorzichtige reactieproduct dat wordt gegenereerd met een chromogene substraat zoals 3, 3 ‘-Diaminobenzidine (DAB) door IHC, indien het gaat om het gebruik van fluorescerende conjugaten die zichtbaar zijn door fluorescentiemicroscopie. Daarom, als kan duidelijk onderscheid maken tussen positieve cellen van achtergrondruis, en laat afbeeldingen kwantitatief worden geanalyseerd en verbeterd op een eenvoudige manier door software zoals imagej en Adobe Photoshop7,8. De hele Mount kleuring aanpak werkt op kleine blokken weefsel (minder dan 5 mm dik), die driedimensionale informatie over de locatie van eiwitten/antigenen kan bieden zonder de noodzaak voor reconstructie uit de rubrieken9,10 . Echter, in vergelijking met weefsel secties, hele Mount immunokleuring is tijdrovend en vereist grote hoeveelheden antilichaam oplossingen. Niet alle antilichamen zijn compatibel met de basisbenadering voor hele montage. Bovendien zal de onvolledige penetratie van antilichamen resulteren in ongelijke kleuring of valse negatieve kleuring. Hier zullen we ons concentreren op de immunofluorescentie detectie van eiwitten/antigenen op verdeelde weefsels. Voor harde weefsels (bv, hoofd, tand, lang bot), calcium depositie tijdens ontwikkeling/pathogenese maakt het monster moeilijk om sectie en gemakkelijk afgespoeld tijdens immunokleurings behandeling11,12. De meeste van de momenteel beschikbare protocollen decalcify harde weefsels vóór inbedding te maken snijden gemakkelijker, dat is tijdrovend en kan de morfologie en antigenen van monsters vernietigen als onjuist behandeld11,12. Om de problemen te overwinnen, hebben we een aanpak geoptimaliseerd voor het cryosnijden van harde weefsels zonder decalcificatie, wat leidt tot een verbeterde visualisatie van hun morfologie en verdeling van signalering van eiwitten.
Het hier beschreven protocol wordt gebruikt om de Morfometrische en histologische veranderingen in de craniofaciale weefsels van BMP-transgene muizen te bepalen. In het bijzonder omvat het Protocol (1) het oogsten en ontleden van het hoofd weefsel, (2) sectie en immunokleuring van experimentele markers (Ki67, pSmad1/5/9) samen met TUNEL kleuring, (3) beeldvorming van de secties met behulp van fluorescentiemicroscoop, en ten slotte (4) analyseren en kwantificeren van de resultaten. Het protocol voor de voorbereiding en cryosectie harde weefsels zonder decalcificatie wordt ook beschreven13. Deze methoden zijn geoptimaliseerd voor craniofaciale weefsels. Ze zijn ook toepasbaar op andere weefsels van verschillende leeftijden van monsters met passende aanpassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de bereiding van de muis hoofd en undecalcified bot weefsels, en cryosnijden voor immunokleuring van celproliferatie, celdood, en BMP-signalering markers. We geven ook een gedetailleerd beeld van de strategie voor het verkrijgen van kwantitatieve gegevens van immunofluorescentie beelden. Deze methoden kunnen ook van toepassing zijn op andere weefsels met passende aanpassingen.
De voorwaarden voor weefsel bereiding variëren afhankelijk van de groo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (R01DE020843 to Y.M.), de International FOP Association (Y.M.), en een subsidie-in-Aid van de National Natural Science Foundation of China (31500788 tot J.Y.).
Materials
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
References
- Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
- Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
- Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
- Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
- Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
- Xiao, C., Dan-Bi, C. Double staining immunohistochemistry. North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).
- Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
- Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
- González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
- Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).
- Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
- Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
- Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
- Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
- Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).
