Préparation des tissus et immunostaining des tissus craniofacial de souris et de l'os non décalcifié
Summary
Ici, nous présentons un protocole détaillé pour détecter et quantifier des niveaux de protéine pendant la morphogénèse/pathogénie craniofacial par immunostaining utilisant des tissus craniofacial de souris comme exemples. En outre, nous décrivons une méthode pour la préparation et la cryosectioning des tissus durs non décalcifiés des jeunes souris pour immunostaining.
Abstract
L’immunostaining tissulaire fournit la détection très spécifique et fiable des protéines d’intérêt dans un tissu donné. Ici nous décrivons un protocole complet et simple pour détecter l’expression de protéine pendant la morphogenèse/pathogénie craniofacial utilisant des tissus craniofacial de souris comme exemples. Le protocole consiste en la préparation et la cryosection des tissus, l’immunofluorescence indirecte, l’acquisition d’images et la quantification. En outre, une méthode pour la préparation et la cryosectioning des tissus durs non décalcifiés pour immunostaining est décrite, utilisant des tissus craniofacial et des os longs comme exemples. Ces méthodes sont essentielles pour déterminer l’expression des protéines et les changements morphologiques/anatomiques dans divers tissus pendant la morphogénèse craniofaciale/pathogénie. Ils sont également applicables à d’autres tissus avec des modifications appropriées. La connaissance de l’histologie et la haute qualité des sections sont essentielles pour tirer des conclusions scientifiques à partir des résultats expérimentaux. Les limites potentielles de cette méthodologie comprennent, sans s’y limiter, la spécificité des anticorps et les difficultés de quantification, qui sont également discutées ici.
Introduction
Le visage est un élément clé de l’identité humaine, et est composé de plusieurs types de tissus, tels que l’épithélium, muscle, os, cartilage, dent. Ces tissus sont dérivés des trois couches germinales: ectoderm, endoderm, et mesoderm1,2. Pour le bon modelage et le développement des tissus craniofacial, la prolifération cellulaire, la mort et la différenciation doivent être fortement coordonnées et réglées par des voies de signalisation spécifiques, telles que Wnt, Fgf, Hh et Bmp voies3,4 ,5. Les défauts dans la prolifération, la survie ou la différenciation des cellules mèneront aux malformations craniofacial, qui sont parmi les défauts congénitaux les plus fréquents de naissance. Les souris transgéniques sont des outils utiles pour étudier les mécanismes de la morphogénèse craniofaciale et de la pathogénie1,2,3,4,5. Comprendre les changements dans les structures craniofaciales au cours du développement et de la pathogénie aidera à clarifier les principes clés du développement ainsi que les mécanismes des malformations craniofaciales1,2,3 ,4,5.
La coloration de monture entière ou de tissus sectionnés avec des anticorps spécifiques est une technique inestimable pour déterminer la distribution spatiale des protéines d’intérêt 6. Formellement, l’immunostaining de tissu peut compter sur l’immunohistochimie (IHC) ou l’immunofluorescence (IF). Par rapport au produit de réaction opaque produit avec un substrat chromogénique tel que 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) par IHC, IF implique l’utilisation de conjugués fluorescents visibles par microscopie fluorescence. Par conséquent, IF peut clairement différencier les cellules positives du bruit de fond, et permet aux images d’être quantitativement analysées et améliorées d’une manière simple par des logiciels tels que ImageJ et Adobe Photoshop7,8. L’approche de coloration de montage entier fonctionne sur de petits blocs de tissu (moins de 5 mm d’épaisseur), qui peuvent fournir des informations tridimensionnelles sur l’emplacement des protéines/antigènes sans avoir besoin de reconstruction des sections9,10 . Cependant, par rapport aux sections de tissu, l’immunostaining de montage entier prend le temps et exige de grands volumes de solutions d’anticorps. Tous les anticorps ne sont pas compatibles avec l’approche de base de la monture entière. En outre, la pénétration incomplète des anticorps entraînera une coloration inégale ou une fausse coloration négative. Ici, nous nous concentrerons sur la détection d’immunofluorescence des protéines/antigènes sur les tissus sectionnés. Pour les tissus durs (par exemple, tête, dent, os long), le dépôt de calcium pendant le développement/pathogénie rend l’échantillon difficile à sectionner et facilement rincé pendant le traitement immunostaining11,12. La plupart des protocoles actuellement disponibles décalciment les tissus durs avant l’intégration pour faciliter la section, ce qui prend du temps et peut détruire la morphologie et les antigènes des échantillons s’ils sont manipulés de façon inappropriée11,12. Pour surmonter les problèmes, nous avons optimisé une approche pour la cryosection des tissus durs sans décalcification, conduisant à une meilleure visualisation de leur morphologie et la distribution des protéines de signalisation.
Le protocole décrit ici est utilisé pour déterminer les changements morphométriques et histologiques dans les tissus craniofacial des souris transgéniques BMP. Plus précisément, le protocole comprend (1) la récolte et la disséquement des tissus crâniens, (2) la section et l’immunostaining des marqueurs expérimentaux (Ki67, pSmad1/5/9) ainsi que la coloration TUNEL, (3) l’imagerie des sections à l’aide du microscope à fluorescence, et enfin (4) l’analyse et la quantification des résultats. Le protocole pour préparer et cryosection tissus durs sans décalcification est également décrit13. Ces méthodes sont optimisées pour les tissus craniofacial. Ils sont également applicables à d’autres tissus de différents âges d’échantillons avec des modifications appropriées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici nous fournissons un protocole détaillé pour la préparation de la tête de souris et des tissus osseux non décalcifiés, et la cryosection ingation pour l’immunostaining de la prolifération cellulaire, de la mort cellulaire, et des marqueurs de signalisation de BMP. Nous détaillons également la stratégie d’obtention de données quantitatives à partir d’images immunofluorescentes. Ces méthodes peuvent également s’appliquer à d’autres tissus avec des modifications appropriées.
Le…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (R01DE020843 à Y.M.), l’International FOP Association (Y.M.) et une subvention de la National Natural Science Foundation of China (31500788 à J.Y.).
Materials
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
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