Fare Kraniyofacial dokularda ve Undecalcified kemik doku hazırlama ve Immünostasyon
Summary
Burada, kraniyofasiyal morphogenesis/patogenezi sırasında protein düzeylerini algılamak ve ölçmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz Buna ek olarak, immünostasyon için genç farelerden undecalcified Sert dokularda hazırlama ve donuk kesit için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Doku immünostası, belirli bir doku içinde ilgi proteinlerinin son derece spesifik ve güvenilir tespiti sağlar. Burada, kraniyofasiyal morphogenesis/patogenezi sırasında fare kraniyofasin dokularında örnek olarak protein ifadesini algılamak için tam ve basit bir protokol açıklanmaktadır. Protokol, dokuların preparasyon ve kriyobölümlenmesini, dolaylı immünofluoresesans, görüntü edinme ve miktarlama içerir. Buna ek olarak, immünostasyon için undecalcified Sert dokularda hazırlık ve donuk kesit için bir yöntem tarif edilir, örnek olarak kraniyofasiyal dokular ve uzun kemikler kullanılarak. Bu yöntemler, kraniyofacial morfogenik/patogenezi sırasında çeşitli dokularda protein ifadesi ve morfolojik/anatomik değişikliklerin belirlenmesi için anahtardır. Onlar da uygun modifikasyonlar ile diğer dokular için geçerlidir. Histolojinin bilgi ve yüksek kalite bölümleri deneysel sonuçlardan bilimsel sonuçlar çekmek için önemlidir. Bu metodolojinin potansiyel sınırlamaları şunlardır ancak antikorların özgüllüğü ve burada da tartışılan ölçüme karşı zorluklar ile sınırlı değildir.
Introduction
Yüz insan kimliğinin önemli bir parçasıdır ve epitelyum, kas, kemik, kıkırdak, diş gibi çeşitli farklı dokulardan oluşur. Bu dokular üç germ katmanından türetilmiştir: ectoderm, endoderm, ve mezoderm1,2. Kraniyofasin dokularının uygun desenleme ve gelişimi için, hücre proliferasyonu, ölüm ve farklılaşma WNT, fgf, hh ve BMP yollar3,4 gibi belirli sinyal yolları tarafından son derece koordine ve düzenlenmiş olması gerekir ,5. Proliferasyon, hayatta kalma veya hücrelerin farklılaşma kusurları, en sık görülen konjenital Doğum kusurları arasında bulunan kraniyofasiyal malformasyonlara yol açacaktır. Transjenik fareler kraniyofasiyal morfogenez ve patogenezi1,2,3,4,5mekanizmaları çalışma için yararlı araçlardır. Geliştirme ve patogenezi sırasında kraniyofasiyal yapılardaki değişikliklerin anlaşılması, anahtar gelişimsel prensiplerin yanı sıra kraniyofasiyal malformasyonların mekanizmalarının açıklığa kavuşturulmasına yardımcı olacaktır1,2,3 ,4,5.
Tüm montaj veya özel antikorlar ile kesitli dokuların boyama ilgi proteinlerinin uzamsal dağılımı belirlemek için paha biçilmez bir tekniktir 6. Resmi olarak, doku immünostans immunhistokimya veya immünofluorescence (IF) üzerine güvenebilir. IFC tarafından 3, 3 ‘-diaminobenzidin (DAB) gibi bir kromojenik substrat ile oluşturulan opak reaksiyon ürünü ile karşılaştırıldığında, floresan Konjugat floresans mikroskobu ile görülebilir kullanımını içerir. Bu nedenle, Eğer net bir şekilde arka plan gürültüsünden pozitif hücreleri ayırt edebilir ve görüntüler nicekatif olarak analiz ve ımagej ve Adobe Photoshop7,8gibi yazılım tarafından basit bir moda geliştirilmiş sağlar. Tüm Mount boyama yaklaşımı doku küçük bloklar üzerinde çalışır (daha az 5 mm kalınlığında), hangi bölümlerden yeniden yapılanma için gerek kalmadan proteinlerin/antijenler konumu hakkında üç boyutlu bilgi sağlayabilir9,10 . Ancak, doku bölümleri ile karşılaştırıldığında, tüm immünostüajlı montaj zaman alıcı ve antikor çözeltileri büyük hacimli gerektirir. Tüm antikorlar temel tüm montaj yaklaşımı ile uyumludur. Buna ek olarak, antikorların tamamlanmamış penetrasyonunu düzensiz boya veya yanlış negatif boyama neden olur. Burada, kesitli dokularda proteinler/antijenlerin immünofluoresesans tespiti üzerine odaklanacağız. Sert dokularda (örn. baş, diş, uzun kemik), gelişim sırasında kalsiyum birikimi/patogenezi numunenin bölüm için zor hale getirir ve immünostam tedavisi sırasında kolayca durulanır11,12. Şu anda mevcut protokoller çoğu zaman tüketen ve yanlış işlenmiş ise numunelerin Morfoloji ve antijenleri yok edebilir, kesit daha kolay yapmak için katıştırma önce sert dokulara kireçsizleştirir11,12. Sorunları aşmak için, biz kireç çözücü olmadan sert dokuların donuk kesit için bir yaklaşım optimize, onların Morfoloji ve sinyal proteinlerinin dağılımı geliştirilmiş görselleştirme yol.
Burada açıklanan protokol, BMP transjenik fareler kraniyofacial dokularda morfometrik ve histolojik değişiklikler belirlemek için kullanılmaktadır. Özellikle, protokol (1) hasat ve diseksiyon kafa dokularında, (2) bölümü ve deneysel işaretçileri (Ki67, pSmad1/5/9) ile birlikte TUNEL boyama, (3), floresan mikroskop kullanarak bölümler görüntüleme ve son olarak (4) immünosterleme içerir sonuçları analiz etmek ve ölçmek. Hazırlama ve çürütme olmadan sert dokular kriyosection için protokol de13açıklanmıştır. Bu yöntemler kraniyofasiyal dokular için optimize edilmiştir. Onlar da uygun modifikasyonlar ile numunelerin çeşitli yaştan diğer dokular için geçerlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada fare kafası ve undecalcified kemik dokularının hazırlanması için ayrıntılı bir protokol ve hücre proliferasyonu, hücre ölümü ve BMP sinyalizasyon işaretçileri immünostasyon için donuk kesit sağlar. Ayrıca immünofluorescent görüntülerden nicel veriler elde etme stratejisini de ayrıntılarıyla biliyoruz. Bu yöntemler, uygun değişikliklerle diğer dokulara da uygulanabilir.
Doku hazırlama koşulları dokuların boyutuna ve tipine göre farklılık gösterir. S…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01DE020843 Y.M.), uluslararası FOP Derneği (Y.M.) ve Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (31500788 J.Y.) bir Grant-in-Aid tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
References
- Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
- Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
- Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
- Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
- Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
- Xiao, C., Dan-Bi, C. Double staining immunohistochemistry. North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).
- Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
- Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
- González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
- Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).
- Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
- Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
- Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
- Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
- Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).
